Novaĵoj

Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Enzimaj proksimecetikedaj metodoj bazitaj sur aktivigitaj esteroj aŭ fenoksiradikaloj estas vaste uzitaj por mapi subĉelajn proteomojn kaj proteininteragantojn en vivantaj ĉeloj.Tamen, aktivigitaj esteroj estas malpli reaktivaj, rezultigante larĝan etikedradiuson, kaj fenoksiradikaloj generitaj per peroksidtraktado povas influi redoksajn padojn.Ĉi tie ni raportas metodon pri dependa fotoaktivigo (PDPL) pri etikedado de proksimeco evoluigita genetike ligante la miniSOG-fotosensibilizan proteinon al interesa proteino.Ekigita per blua lumo kaj kontrolita per ekspontempo, singlet-oksigeno estas generita kaj tiam spatiotempe solvita etikedado de histidinrestaĵoj per la anilinsondilo estas atingita.Ni pruvas ĝian altan fidelecon per organel-specifa proteommapado.Flank-al-flanke komparo de PDPL kun TurboID montras pli specifan kaj ampleksan proteomian priraportadon de PDPL.Poste, ni aplikis PDPL al la malsano-rilata transskriba kunaktiviganto BRD4 kaj E3 Parkin-ligazo kaj trovis antaŭe nekonatajn interagantojn.Per troesprimrastrumo, du nekonataj substratoj, Ssu72 kaj SNW1, estis identigitaj por Parkin, kies degenero estas mediaciita per la ubikvitinad-proteazoma pado.
Preciza karakterizado de proteinretoj subestas multajn fundamentajn ĉelajn procesojn.Tial, tre preciza spatiotempomapado de proteininteragoj disponigos molekulan bazon por deĉifrado de biologiaj padoj, malsanpatologio, kaj interrompado de tiuj interagoj por terapiaj celoj.Tiucele, metodoj kapablaj je detektado de tempaj interagoj en vivantaj ĉeloj aŭ histoj estas tre dezirindaj.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) estis historie uzita por identigi ligajn partnerojn de proteinoj de intereso (POI).Kun la evoluo de kvantaj proteomikaj metodoj, Bioplex3.0 estis kreita, la plej granda datumbazo de proteinretoj bazitaj sur AP-MS.Kvankam AP-MS estas tre potenca, la ĉellizo kaj diluopaŝoj en la laborfluo estas partiaj direkte al malfortaj kaj pasemaj devigaj interagoj kaj enkondukas post-lizajn artefaktojn kiel ekzemple falsaj interagaj paroj al kiuj mankas sekcio antaŭ lizo.
Por trakti ĉi tiujn aferojn, nenaturaj aminoacidoj (UAA) kun interligaj grupoj kaj enzimecaj proksimaj etikedaj (PL) platformoj (ekz. APEX kaj BioID)5 estis evoluigitaj.Kvankam la UAA-metodo estis sukcese aplikita en multaj scenaroj kaj disponigas informojn pri rektaj proteingluoj, optimumigo de la UAA-enmetejo daŭre estas postulata.Pli grave, ĝi estas stoiĥiometria etikedmetodo al kiu mankas kataliza inversigo de etikedaj okazaĵoj.En kontrasto, enzimecaj PL-metodoj, kiel ekzemple la BioID-metodo, kunfandas la realigitan biotinligazon al POI7, kiu poste aktivigas biotinon por formi reaktivan biotinil-AMP-esteran mezan.La enzimo tiel katalizas kaj liberigas aktivigitan biotinon "nubon" kiu etikedas proksimajn lizinrestaĵojn.Tamen, BioID postulas pli ol 12 horojn por akiri sufiĉan etikeditan signalon, kio malhelpas ĝian uzon kun tempa rezolucio.Uzante direktitan evoluon bazitan sur gista ekrano, TurboID estis dizajnita surbaze de BioID por esti pli efika, permesante efikan etikedadon kun biotino ene de 10 minutoj, permesante pli dinamikajn procezojn esti studitaj.Ĉar TurboID estas tre aktiva kaj endogenaj biotinniveloj estas sufiĉaj por malalt-nivela etikedado, fonetikedado iĝas ebla problemo kiam altagrade plifortigita kaj tempigita etikedado estas postulata per la aldono de eksogena biotino.Krome, aktivigitaj esteroj estas nebone reaktivaj (t1/2 ~5 min), kio povas konduki al granda etikedradiuso, precipe post saturiĝo de najbaraj proteinoj kun biotino 5. En alia aliro, genetika fuzio de inĝenierita askorbatperoksidazo (t.e. biotin- fenolaj radikaluloj kaj permesas proteinetikedadon ene de unu minuto9, 10. APEX estas vaste uzata por identigi subĉelajn proteomojn, membranajn proteinkompleksojn kaj citosolajn signalajn proteinkompleksojn11, 12. Tamen, la bezono de altaj koncentriĝoj de peroksidoj povas influi redox-proteinojn aŭ vojojn, interrompante. ĉelaj procezoj.
Tiel, nova metodo kapabla je generado de pli reaktivaj etiked-radiaj subpremadspecioj kun alta spaca kaj tempa precizeco sen signife interrompado de ĉelaj padoj estos grava aldono al ekzistantaj metodoj. Inter la reaktivaj specioj, singlet-oksigeno vekis nian atenton pro sia mallonga vivdaŭro kaj limigita difuzradiuso (t1/2 < 0,6 µs en ĉeloj)13. Inter la reaktivaj specioj, singlet-oksigeno vekis nian atenton pro sia mallonga vivdaŭro kaj limigita difuzradiuso (t1/2 < 0,6 µs en ĉeloj)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Inter la aktivaj formoj, singleta oksigeno altiris nian atenton pro sia mallonga vivdaŭro kaj limigita difuzradiuso (t1/2 < 0,6 µs en ĉeloj)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs（中其滆滆浄滺滆有限（细胞中t1/2 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Inter aktivaj formoj, singlet-oksigeno altiras nian atenton pro sia mallonga vivdaŭro kaj limigita difuzradiuso (t1/2 < 0.6 μs en ĉeloj).Unuoksigeno estis raportita hazarde oksigeni metioninon, tirozinon, histidinon kaj triptofanon, igante ĝin polusa 14,15 por alkroĉado al amino aŭ tiolbazitaj enketoj16,17.Kvankam singlet-oksigeno estis uzita por etikedi subĉelan kupeon RNA, strategioj por reuzigado de endogenaj POI-proksimecsignoj restas neesploritaj.Ĉi tie, ni prezentas platformon nomitan fotoaktivigo-dependa proksimeco-etikedado (PDPL), kie ni uzas bluan lumon por lumigi POI-ojn kunfanditajn kun miniSOG-fotosensibiligilo kaj ekigas singlet-oksigenan generacion por oksigeni proksimajn restaĵojn, sekvitajn de amin-enhavantaj modifoj por oksigeni kemiajn enketojn en kemiajn enketojn. mezaj vivantaj ĉeloj..Ni testis grupon de kemiaj enketoj por maksimumigi etikedspecifecon kaj identigis modifejojn uzante malferman proteomikan laborfluon.Flank-al-flanke komparo de PDPL kun TurboID montras pli specifan kaj ampleksan proteomian priraportadon de PDPL.Ni aplikis ĉi tiun aliron al organel-specifaj signoj de la subĉela proteomo kaj ĝenerala proteoma identigo de ligantaj partneroj por la kancero-rilata epigenetika reguliga proteino BRD4 kaj la Parkinson-malsano-rilata E3 ligase Parkin, kiuj konfirmis kaj konatan kaj nekonatan reton de proteino. interagoj..La kapablo de PDPL rekoni E3-substratojn en grandaj proteinkompleksoj reprezentas situacion kie rekono de nerektaj ligiloj estas postulata.Du nekonataj parkinsubstratoj mediaciitaj per ubikvitinacio-proteazomo estis konfirmitaj surloke.
Fotodinamika terapio (PDT)19 kaj kromofor-helpita lasera malaktivigo (CALI)20, en kiu malpeza surradiado kun fotosensibilizantoj generas singlet-oksigenon, povas malaktivigi celproteinojn aŭ kaŭzi ĉelmorton.Ĉar singlet-oksigeno estas tre reaktiva substanco kun teoria difuzdistanco de proksimume 70 Nm, space limigita oksigenado ĉirkaŭ la fotosensibiligilo povas esti kontrolita.Surbaze de ĉi tiu koncepto, ni decidis uzi singlet-oksigenon por atingi proksiman etikedadon de proteinkompleksoj en vivantaj ĉeloj.Ni evoluigis PDPL-kemoproteomian aliron por plenumi kvar funkciojn: (1) katalizi la generacion de aktiva singlet-oksigeno simila al la PL-enzima aliro;(2) provizi temp-solvitan etikedon sur malpeza inico;(3) per ŝanĝo (4) Evitu uzi endogenajn kofaktorojn (kiel ekzemple biotino) por redukti fonon, aŭ uzi tre perturbajn eksogenajn reakcilojn (kiel ekzemple peroksidoj) por minimumigi ĉelan eksponiĝon al media streso.
Fotosensivigiloj povas esti dividitaj en du kategoriojn inkluzive de malgrandaj molekula pezaj fluoroforoj (ekz. roza bengala, metilenbluo)22 kaj genetike kodigitaj malgrandaj proteinoj (ekz. miniSOG, KillerRed)23.Por atingi modulan dezajnon, ni evoluigis la unuan generacion PDPL-platformon aldonante fotosensibiligajn (PS) proteinojn al POI24,25 (Figuro 1a).Kiam surradiita kun blua lumo, singlet-oksigeno oksigenas proksimajn nukleofilajn aminoacidrestaĵojn, rezultigante umpolungan polusecon kiu estas elektrofila kaj povas plu reagi kun aminsondilaj nukleofiloj16,17.La sondilo estas desegnita kun alkina tenilo por permesi klakkemion kaj tiri malsupren por LC/MS/MS karakterizado.
Skema ilustraĵo de etikedado de proteinkompleksoj mediaciitaj per miniSOG.Se eksponite al blua lumo, ĉeloj esprimantaj miniSOG-POI generas singlet-oksigenon, kiu modifas interrilatantajn proteinojn sed ne ne-devigajn proteinojn.Mezaj produktoj de fotooksidado estas kaptitaj per relajsetikedoj de la amina kemia enketo por formi kovalentajn aduktojn.La alkinilgrupo sur la kemienketo permesas klakkemion por riĉigo per tirmalsupren sekvita per LC-MS/MS-kvanto.b Kemia strukturo de aminaj sondoj 1-4.c Reprezenta fluoreska ĝela analizo de mitokondriaj lokalizitaj miniSOG-mediaciitaj proteomaj markiloj uzante enketojn 1-4 kaj relativan kvantigon bazitan sur ĝela densitometrio.La signal-al-fono-proporcio de kemiaj enketoj estis taksita uzante negativajn kontroleksperimentojn ekskludante bluan lumon aŭ uzante HEK293T-ĉelojn sen miniSOG-esprimo.n = 2 biologie sendependaj specimenoj.Ĉiu punkto reprezentas biologian kopion.d Reprezenta detekto kaj kvantigo de PDPL uzante optimumigitan enketon 3 en la ĉeesto aŭ foresto de la indikitaj PDPL-komponentoj kiel ĉ.n = 3 biologie sendependaj specimenoj.Ĉiu punkto reprezentas biologian kopion.Mezlinioj kaj buŝbaroj reprezentas la meznombran kaj ± norman devion.CBB: Coomassie Brila Bluo.e Konfokusa bildigo de singlet-oksigeno kun malproksimruĝa Si-DMA-makulo.Skalstango: 10 µm.Gelbildigo kaj konfokusaj eksperimentoj estis sendepende ripetitaj almenaŭ dufoje kun similaj rezultoj.
Ni unue testis la kapablon de la maturaj fotosensibiligiloj miniSOG26 kaj KillerRed23, stabile esprimitaj en HEK293T, por mediacii propargilaminan etikedadon de la proteomo kiel kemia enketo (Suplementa Fig. 1a).Ĝela fluoreskeca analizo montris ke tuta proteom-etikedado estis atingita uzante miniSOG kaj bluan lumon surradiadon, dum neniu videbla etikedprodukto estis observita kun KillerRed.Por plibonigi la signal-al-fono-proporcion, ni tiam testis aron da kemiaj sondiloj enhavantaj anilinon (1 kaj 3), propilaminon (2), aŭ benzilaminon (4).Ni observis, ke HEK293T-ĉeloj mem havis pli altan fonan signalon kompare kun neniu blua lumo, eble pro la endogena riboflavina fotosensibilizador, flavinmononucleotide (FMN) 27 . Anilin-bazitaj kemiaj enketoj 1 kaj 3 donis pli bonan specifecon, kie HEK293T stabile esprimas miniSOG en mitokondrioj elmontrante >8-oblan pliiĝon en signalo por enketo 3, dum enketo 2 uzita en la RNA-etikedmetodo CAP-seq nur montras ~2.5- faldsigna pliiĝo, verŝajne pro malsamaj reagemaj preferoj inter RNA kaj proteino (Fig. 1b, c). Anilin-bazitaj kemiaj enketoj 1 kaj 3 donis pli bonan specifecon, kie HEK293T stabile esprimas miniSOG en mitokondrioj elmontrante >8-oblan pliiĝon en signalo por enketo 3, dum enketo 2 uzita en la RNA-etikedmetodo CAP-seq nur montras ~2.5- faldsigna pliiĝo, verŝajne pro malsamaj reagemaj preferoj inter RNA kaj proteino (Fig. 1b, c).Anilin-bazitaj kemiaj enketoj 1 kaj 3 montris pli bonan specifecon: HEK293T, kiu stabile esprimas miniSOG en mitokondrioj, montras pli ol 8-oblan pliiĝon en signalo por enketo 3, dum enketo 2, uzita en la CAP-seq RNA-etikedmetodo, nur montras. montras ~2.5-oblan signalpliiĝon, verŝajne pro malsamaj reagemaj preferoj inter RNA kaj proteino (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号> 8 倍 ， 而 用 于 rna 标记 方法 ĉap-seq 的 2 仅 显示 ~ 于 rna 标记 方法 方法 信号 探针 2 仅 显示 ~ 于 rna 标记 方法 方法 的 2 仅 2 仅 ~ 显示 ~ 于 rna 标记 方法 方法 的 2 仅 2 仅 ~ 显示 ~ 显示 ~ 显示 rna 标记 方法 的 2 仅 2 仅 ~ 显示 ~ 显示 rna 标记 方法 2 仅 2 仅 2 仅 ~ 显示. 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 minisog ， 探针 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而 于 于 rna 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAnilin-bazitaj kemiaj enketoj 1 kaj 3 havis pli bonan specifecon, HEK293T stabile esprimis miniSOG en mitokondrioj, kaj enketo 3 havis pli ol 8-oblan pliiĝon en signalo, dum enketo 2 por la CAP-seq RNA-etikedmetodo montris nur ~2.5-oblan pliiĝon.en la signalo, verŝajne pro malsamaj reagaj preferoj inter RNA kaj proteino (Fig. 1b, c).Krome, enketoj 3-izomeroj kaj hidrazinaj sondiloj (sondiloj 5, 6, 7) estis provitaj, konfirmante la optimumigo de enketo 3 (Suplementa Fig. 1b, c).Simile, en-ĝela fluoreskeca analizo malkaŝis aliajn optimumigitajn eksperimentajn parametrojn: ondolongo de surradiado (460 nm), koncentriĝo de kemia sondilo (1 mM) kaj tempo de surradiado (20 min) (Sulementa Fig. 2a–c).Forlasi ajnan komponanton aŭ paŝon en la PDPL-protokolo rezultigis signifan signalan reverton al la fono (Fig. 1d).Precipe, proteinetikedado estis signife reduktita en la ĉeesto de natriazido aŭ trolox, kiuj povas estingi singlet-oksigenon.La ĉeesto de D2O, kiu povas stabiligi singlet-oksigenon, plibonigas la etikedsignalon.Por esplori la kontribuon de aliaj reaktivaj oksigenaj specioj al etikedado, manitolo kaj C-vitamino estis aldonitaj por establi hidroksilajn kaj superoksidajn radikalulojn, respektive, 18, 29, sed ili ne estis trovitaj redukti etikedadon.Aldono de H2O2, sed ne lumigado, ne rezultigis etikedadon (Suplementa Fig. 3a).Fluoreskeca singlet-oksigenbildigo per Si-DMA-enketoj konfirmis la ĉeeston de singlet-oksigeno en la HEK293T-miniSOG-drato, sed ne en la origina HEK293T-drato.Krome, mitoSOX Red ne povis detekti superoksidan produktadon post lumigado (Fig. 1e kaj Suplementa Fig. 3b) 30. Ĉi tiuj datumoj forte sugestas, ke singlet-oksigeno estas la ĉefa reaktiva oksigena specio respondeca por posta proteomia etikedado.Citotokseco de PDPL estis taksita inkluzive de blua lumo-surradiado kaj kemiaj sondoj, kaj neniu signifa citotokseco estis observita (Suplementa Fig. 4a).
Por studi la etikedan mekanismon kaj ebligi proteomian identigon de proteinkompleksoj uzante LC-MS/MS, ni unue devas determini kiuj aminoacidoj estas modifitaj kaj la delta maso de enketetikedoj.Metionino, histidino, triptofano kaj tirozino estis raportitaj esti modifitaj per singleta oksigeno14,15.Ni integras la laborfluon TOP-ABPP31 kun la nepartia malferma serĉo provizita de la komputika platformo FragPipe bazita sur MSFragger32.Post singlet-oksigenmodifo kaj kemia enketetikedado, klakkemio estis farita uzante biotinan reduktetikedon enhavantan fendiĝeblan ligilon, sekvitan per neŭtravidin-streĉado kaj tripsindigestado.La modifita peptido, ankoraŭ ligita al la rezino, estis fotofendita por analizo LC-MS/MS (Figuro 2a kaj Suplementaj Datumoj 1).Granda nombro da modifoj okazis tra la proteomo kun pli ol 50 peptidaj mapoj (PSM) matĉoj listigitaj (Fig. 2b).Surprize, ni nur observis modifon de histidino, verŝajne pro la pli alta reagemo de oksigenita histidino al anilinsondiloj ol aliaj aminoacidoj.Laŭ la publikigita mekanismo de histidinoksigenado per singleta oksigeno,21,33 la proponita deltamasa strukturo de +229 Da egalrilatas al la adukto de enketo 3 kun 2-okso-histidino post du oksidiĝoj, dum +247 Da estas la hidroliza produkto. de +229 Da (Suplementa Fig. 5).La taksado de la MS2-spektro montris altan fidindecon de identigo de la plej multaj el la jonoj y kaj b, inkluzive de la identigo de modifitaj fragmentaj jonoj (y kaj b) (Fig. 2c).Kunteksta analizo de la loka sekvenco de PDPL-modifitaj histidinoj malkaŝis moderan motivon-preferon por malgrandaj hidrofobaj restaĵoj ĉe ± 1 pozicioj (Suplementa Fig. 4b).Averaĝe, 1.4 histidinoj estis identigitaj per proteino, kaj la lokoj de ĉi tiuj markiloj estis determinitaj per solventa alirebla surfacareo (SASA) kaj relativa solva havebleco (RSA) analizo (Suplementa Fig. 4c, d).
Senantaŭjuĝa laborfluo por studi restan selektivecon per la komputika platformo FragPipe funkciigita de MSFragger.Fendeblaj ligiloj estas uzitaj en Klakkemio por permesi fotofendiĝon de modifitaj peptidoj de streptavidinrezino.Malferma serĉo estis lanĉita por identigi multajn modifojn, same kiel koncernajn restaĵojn.b Asignu la mason de modifoj okazantaj tra la proteomo.Peptida mapado PSM.c MS2-spektra komentario de histidinejoj modifitaj per enketo 3. Kiel reprezenta ekzemplo, kovalenta reago kun enketo 3 aldonis +229.0938 Da al la modifita aminoacido.d Mutacia analizo uzata por testi pri PDPL-signoj.PRDX3 (H155A, H225A) kaj PRDX1 (H10A, H81A, H169A) estis transfektitaj kun sovaĝ-specaj plasmidoj por kontraŭ-Flag-detekto.e La sinteza peptido estis reagita per purigita miniSOG en ĉeesto de enketo 3 kaj la respondaj produktoj kun Δm +247 kaj +229 estis notitaj en la LC-MS-spektro.f In vitro protein-al-proteina interagoj modeligitaj kun miniSOG-6xHis-etikedo kaj kontraŭ-6xHis antikorpo.Antibiotino (streptavidin-HRP) kaj kontraŭ-musa Western blot analizo de miniSOG-6xHis/anti-6xHis antikorpkompleksoj etikeditaj kun enketo 3, depende de la tempo de eksponiĝo al lumo.Etikedoj por individuaj proteinoj estas esprimitaj en la responda molekula pezo: LC-antikorpa malpeza ĉeno, HC-antikorpa peza ĉeno.Ĉi tiuj eksperimentoj estis sendepende ripetitaj almenaŭ dufoje kun similaj rezultoj.
Por biokemia konfirmo de la etikedejo, PRDX3 kaj PRDX1 identigitaj per mas-spektrometrio estis ŝanĝitaj de histidino al alanino kaj komparitaj al sovaĝa tipo en transfektaj analizoj.La PDPL-rezultoj montris, ke la mutacio signife reduktis etikedadon (Fig. 2d).Dume, la peptidaj sekvencoj identigitaj en la malferma serĉo estis sintezitaj kaj reagis in vitro per purigita miniSOG en ĉeesto de enketo 3 kaj blua lumo, donante produktojn kun masoŝanĝo de +247 kaj +229 Da kiam detektita de LC-MS (Fig. . 2e).).Por provi ĉu interrilatantaj proksimaj proteinoj povus esti etikeditaj en vitro en respondo al miniSOG-fotoaktivigo, ni desegnis artefaritan proksimecan analizon per interagado inter la proteino miniSOG-6xHis kaj kontraŭ-Lia unuklona antikorpo en vitro (Figuro 2f).En ĉi tiu provo, ni atendis proksiman etikedadon de antikorpaj pezaj kaj malpezaj ĉenoj kun miniSOG.Fakte, kontraŭ-muso (rekonante la pezajn kaj malpezajn ĉenojn de kontraŭ-6xHis-etikedita antikorpo) kaj streptavidin Western blots montris fortan biotinilation de la pezaj kaj malpezaj ĉenoj.Precipe, ni rimarkis miniSOG-aŭtobiotiniladon pro la 6xHis-etikedo kaj kruc-ligoj inter malpezaj kaj pezaj ĉenoj, kiuj eble rilatas al la antaŭe priskribita interspaco inter lizino kaj 2-oxo-histidina proksimala respondo.Konklude, ni konkludas, ke PDPL modifas histidinon en proksimeco dependa maniero.
Nia sekva celo estis karakterizi la subĉelan proteomon por testi la specifecon de surloka etikedado.Tial ni stabile esprimis miniSOG en la kerno, mitokondria matrico aŭ ekstera ER-membrano de HEK293T-ĉeloj (Fig. 3a).Ĝela fluoreskeca analizo malkaŝis abundajn etikeditajn bandojn ĉe tri subĉelaj lokoj kaj ankaŭ malsamajn etikedajn ŝablonojn (Fig. 3b).Fluoreska bilda analizo montris altan specifecon de PDPL (Fig. 3c).La PDPL-laborfluo estis sekvita per klakreagoj kun rodaminaj tinkturfarboj por marki subĉelajn proteomojn uzantajn fluoreskecmikroskopion, kaj PDPL-signaloj estis kolokalizataj kun DAPI, mitokondriaj spuriloj aŭ ER-spuriloj, konfirmante la altan fidelecon de PDPL.Por la tri organellokoj, flank-al-flanke komparo de PDPL kun TurboID uzanta avidin-okcidentan makulon montris ke PDPL estis etikedita pli specife komparite kun iliaj respektivaj kontroloj.Sub PDPL-kondiĉoj, pli etikeditaj bandoj aperis, indikante pli da PDPL-etikeditaj proteinoj (Suplementa Fig. 6a-d).
Skema reprezentado de miniSOG-mediaciita organel-specifa proteometikedado.miniSOG celas la mitokondrian matricon per fuzio al la N-fina 23 aminoacidoj de homa COX4 (mito-miniSOG), la nukleon per fuzio al H2B (nukleo-miniSOG), kaj Sec61β per la citoplasma flanko de la ER-membrano (ER-miniSOG). ).Indikoj inkludas ĝelbildigon, konfokusan bildigon, kaj mas-spektrometrion.b Reprezentaj ĝelbildoj de tri organel-specifaj PDPL-profiloj.CBB Coomassie Brila Bluo.c Reprezentaj konfokusaj bildoj de HEK293T-ĉeloj stabile esprimantaj miniSOG kun malsamaj subĉelaj lokalizoj detektitaj per antikorpo etikedita V5 (ruĝa).Subĉelaj signoj estas uzataj por mitokondrioj kaj ER (verdaj).La PDPL-laborfluo inkludas la detekton de miniSOG (flavaj) etikeditaj subĉelaj proteomoj uzante Cy3-azida klakkemion.Skalstango: 10 µm.d Vulkanaj intrigoj de PDPL-etikeditaj proteomoj en diversaj organetoj kvantigitaj per neetikedita kvantigo (n = 3 sendependaj biologiaj eksperimentoj).La t-testo de Duvosta Studento estis uzita sur vulkanintrigoj.HEK293T sovaĝa tipo estis uzata kiel negativa kontrolo. Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p < 0.05 kaj > 2-obla jona intensecdiferenco). Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p < 0.05 kaj > 2-obla jona intensecdiferenco). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосни в интесо). Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p <0.05 kaj >2-obla diferenco en jona intenseco).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей ионлей). Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p <0.05 kaj> 2-obla diferenco en jona forto).Rilataj proteinoj gravaj por HEK293T-miniSOG sed ne gravaj por HEK293T estas montritaj en verdo.e Analizo de la specifeco de proteomiaj datumaroj de eksperimentoj d.La tutsumo de statistike signifaj proteinoj en ĉiu organelo (ruĝaj kaj verdaj punktoj) estas markita ĉe la supro.Histogramoj montras proteinojn lokalizitaj en organetoj bazitaj sur MitoCarta 3.0, GO-analizo kaj A. Ting et al.homoj.Apartaj datenoj por mitokondrioj, nukleoj kaj ER.Ĉi tiuj eksperimentoj estis sendepende ripetitaj almenaŭ dufoje kun similaj rezultoj.Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.
Kuraĝigite de la ĝelo kaj bildigaj rezultoj, senetikeda kvantigo estis uzata por kvantigi la identigitan proteomon en ĉiu organelo (Suplementaj Datumoj 2).Netransfektita HEK293T estis uzata kiel negativa kontrolo por subtrahi fonsignojn. Vulkana intrigo-analizo montris signife riĉigitajn proteinojn (p < 0.05 kaj> 2-obla jona intenseco) same kiel unuoblajn proteinojn, kiuj nur ĉeestas en miniSOG-esprimaj linioj (Fig. 3d ruĝaj kaj verdaj punktoj). Vulkana intrigo-analizo montris signife riĉigitajn proteinojn (p < 0.05 kaj> 2-obla jona intenseco) same kiel unuoblajn proteinojn, kiuj nur ĉeestas en miniSOG-esprimaj linioj (Fig. 3d ruĝaj kaj verdaj punktoj). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Vulkanintrig-analizo montris signife riĉigitajn proteinojn (p<0.05 kaj> 2-obla jona intenseco) same kiel ununurajn proteinojn, kiuj nur ĉeestas en miniSOG-esprimaj linioj (Fig. 3d, ruĝaj kaj verdaj punktoj).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子） 以及 仅 存 在于 minisog 表达 系 中 单一 蛋白质 （图 3D 红色 和 绿色点）。火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 图））） 。。。））））））））））））））））））））））））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Vulkanintriga analizo malkaŝis signife riĉigitajn proteinojn (p<0.05 kaj> 2x jonan forton) same kiel ununurajn proteinojn nur ĉeestantajn en la miniSOG-esprimlinio (ruĝaj kaj verdaj punktoj en Fig. 3d).Kombinante ĉi tiujn datumojn, ni identigis 1364, 461 kaj 911 statistike signifajn nukleajn, mitokondriajn, kaj ER eksterajn membranproteinojn, respektive.Por analizi la precizecon de organel-lokigita PDPL, ni uzis MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) analizo, kaj A. Ting et al.datumaro8 estis uzata por mitokondrioj, kerno kaj ER por testi la organecan specifecon de la detektitaj proteinoj, respondante al precizeco de 73.4, 78.5 kaj 73.0% (Fig. 3e).La specifeco de PDPL konfirmas ke PDPL estas ideala ilo por identigado de organel-specifaj proteomoj.Precipe, submitokondria analizo de identigitaj mitokondriaj proteinoj montris, ke la kaptita proteomo estis plejparte distribuita en la matrico kaj interna membrano (226 kaj 106, respektive), respondecante pri 91.7% (362) de la totala nombro de identigitaj mitokondriaj proteinoj.alta nivelo de PDPL estis aldone konfirmita (Suplementa Fig. 7a).Simile, subnuklea analizo montris, ke la kaptita proteomo estis plejparte distribuita en la kerno, nukleoplasmo kaj nukleolo (Suplementa Fig. 7b).Nuklea proteomia analizo kun nuklea lokaliza signalpeptido (3xNLS) montris similan precizecon al la H2B-konstruaĵo (Suplementa Fig. 7c–h).Por determini la specifecon de la PDPL-signo, nuklea laminino A estis elektita kiel pli diskrete lokalizita POI7-kaptilo.PDPL identigis 36 signife riĉigitajn proteinojn, el kiuj 12 proteinoj (30.0% inkluzive de lamin A) estis bone karakterizitaj lamin A interrilatantaj proteinoj komentitaj per la String-datumbazo, kun pli alta procento ol la BioID-metodo (122 proteinoj) 28 el 28. , 22.9 %) 7. Nia metodo identigis malpli da proteinoj, eble pro limigitaj etikedareoj, kio estis ebligita per pli aktiva singlet-oksigeno.GO-analizo montris, ke la identigitaj proteinoj troviĝas ĉefe en la nukleoplasmo (26), nuklea membrano (10), nuklea membrano (9) kaj nukleaj poroj (5).Kolektive, ĉi tiuj nukleaj lokalizitaj proteinoj konsistigis 80% de la riĉigitaj proteinoj, plie pruvante la specifecon de PDPL (Suplementa Fig. 8a–d).
Establinte la kapablon de PDPL fari proksimen markadon en organetoj, ni tiam testis ĉu PDPL povus esti uzata por analizi POI-ligantajn partnerojn.Aparte, ni serĉis difini PDPL-analizon de citosolaj proteinoj, kiuj estas konsiderataj pli malfacilaj celoj ol siaj membran-lokigitaj ekvivalentoj pro sia tre dinamika naturo.La bromodoma kaj ekstertermina (BET) proteino BRD4 altiris nian atenton pro sia ŝlosila rolo en diversaj malsanoj 35, 36.La komplekso formita de BRD4 estas transkripcia kunaktiviganto kaj grava terapia celo.Reguligante la esprimon de c-myc kaj Wnt5a transkripcifaktoroj, BRD4 supozeble estas ŝlosila determinanto de akuta mieloida leŭkemio (AML), multobla mjelomo, la limfomo de Burkitt, kojlokancero kaj inflamaj malsanoj37,38.Krome, iuj virusoj celas BRD4 por reguligi virusan kaj ĉelan transskribon, kiel papilomaviruso, HIV kaj SARS-CoV-236,39.
Por mapi la BRD4-interagon uzante PDPL, ni kombinis miniSOG kun mallonga N- aŭ C-fina izoformo de BRD4.Proteomaj rezultoj malkaŝis altan gradon de interkovro inter la du konstruaĵoj (Suplementa Fig. 9a).La nuklea proteomo identigita kun miniSOG-H2B kovras 77.6% de la proteinoj interagaj kun BRD4 (Suplementa Fig. 9b).Tiam, malsamaj tempoj de lumigado (2, 5, 10, 20 min) estis uzataj por ĝustigi la markilan radiuson (Fig. 4a kaj suplementaj datumoj 3).Ni konkludas, ke ĉe pli mallongaj fotoperiodoj, PDPL ĉefe etikedos rektajn ligajn partnerojn, dum pli longaj periodoj inkluzivos proteinojn identigitajn dum pli mallongaj fotoaktivigaj periodoj same kiel nerektajn celojn en etikedaj kompleksoj.Fakte, ni trovis fortan interkovron inter apudaj tempopunktoj (84.6% por 2 kaj 5 minutoj; 87.7% por 5 kaj 10 minutoj; 98.7% por 10 kaj 20 minutoj) (Fig. 4b kaj Suplementa Fig. 9c).En ĉiuj eksperimentaj grupoj, ni trovis ne nur BRD4 mem-etikedadon, sed plurajn konatajn celojn kiel MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A kaj HMGB1 komentitaj en la korda datumbazo.La jona forto de ĉi tiuj celoj estas proporcia al la malkovrotempo (Fig. 4c kaj Suplementa Fig. 9d).GO-analizo de la proteinoj identigitaj en la 2-minuta grupo montris, ke la identigitaj proteinoj estis lokalizitaj en la kerno kaj estis implikitaj en kromatina restrukturado kaj RNA-polimerazo-funkcio.La molekula funkcio de la proteino estis riĉigita en kromatina ligado aŭ transskriba kunaktivigo, kongrua kun BRD4-funkcio (Fig. 4d).Analizo pri interagado de proteino ebligita ĉendatumbazo rivelis unuan nivelon de nerektaj interagoj inter BRD4 kaj HDAC-familio interrilatantaj kompleksoj kiel SIN3A, NCOR2, BCOR, kaj SAP130 (Fig. 4e kaj Suplementary Fig. 9e), kongrua kun BRD4 kaj HDAC ligantaj acetilitajn histonojn. ..Krome, reprezentaj celoj identigitaj de LC-MS/MS, inkluzive de Sin3A, NSUN2, Fus kaj SFPQ, estis konfirmitaj per okcidenta blotting (Fig. 4f).Lastatempe, la mallonga izoformo de BRD4 estis raportita formi nukleojn kun likva-likva faza apartigo (LLPS) trajtoj.La RNA-ligantaj proteinoj Fus kaj SFPQ mediacias la LLPS de diversaj ĉelaj procesoj kaj estis identigitaj ĉi tie kiel neregistritaj BRD4-ligantaj proteinoj.La interago inter BRD4 kaj SFPQ estis konfirmita per eksperimentoj kun imunoprecipitado (ko-IP) (Figuro 4g), sugestante alian mekanismon por BRD4-mediaciita likva-likva faza apartigo meritanta plian esploron.Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke PDPL estas ideala platformo por identigi konatajn BRD4 interrilatantajn same kiel nekonatajn ligajn proteinojn.
Skema reprezentado de miniSOG-mediaciita BRD4 proksimecmarkado, ekspontempoj: 2, 5, 10, kaj 20 min.b Interkovro de proteinoj identigitaj en malsamaj lumtempoj.Proteinriĉigo identigita en HEK293T-miniSOG-BRD4 estis statistike signifa kompare kun sovaĝa tipo HEK293T.c Jonintenseco dum kvantigado de neetikeditaj reprezentantoj konataj BRD4-ligaj proteinoj dum la specifita ekspontempo.n = 3 biologie sendependaj specimenoj.Datenoj estas prezentitaj kiel meznombro ± norma devio.d Gena ontologia analizo (GO) de proteinoj identigitaj en la 2-minuta grupo.La unuaj dek GO-terminoj estas listigitaj.Vezikoj estas kolorigitaj laŭ la GO-terminkategorio, kaj bobelgrandeco estas proporcia al la nombro da proteinoj trovitaj en ĉiu esprimo.e Stringanalizo de proteinoj interagaj kun BRD4.La flavaj cirkloj estas rekta gluo kaj la grizaj cirkloj estas la unua tavolo de nerekta gluo.La ruĝaj linioj reprezentas la eksperimente determinitajn interagojn kaj la bluaj linioj reprezentas la antaŭdiritajn interagojn.f Reprezentaj BRD4-ligantaj celoj identigitaj en LC-MS/MS estis kontrolitaj per okcidenta blotting.g Ko-immunoprecipitation-eksperimentoj konfirmas la interagadon inter SFPQ kaj BRD4.Ĉi tiuj eksperimentoj estis sendepende ripetitaj almenaŭ dufoje kun similaj rezultoj.Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.
Krom identigi neregistritajn POI-rilatajn celojn, ni hipotezas, ke PDPL taŭgos por identigi substratojn por enzimoj, kiuj postulus la karakterizadon de nerektaj ligaj proteinoj en grandaj kompleksoj por komenti neregistritajn substratojn.Parkino (ĉifrita de PARK2) estas E3-ligazo kaj mutacioj en parkino povas kaŭzi aŭtosoman recesivan junulan Parkinson-malsanon (AR-JP)42.Krome, parkino estis priskribita kiel esenca por mitofagio (mitokondria aŭtofagio) kaj forigo de reaktivaj oksigenspecioj.Tamen, kvankam pluraj parkinsubstratoj estis identigitaj, la rolo de parkin en tiu malsano restas neklara.Por komenti ĝiajn nekarakterigitajn substratojn, PDPL estis testita aldonante miniSOG al la N- aŭ C-finaĵo de parkino.Ĉeloj estis traktitaj per la karbonilcianida protontransportilo m-klorofenilhidrazono (CCCP) por aktivigi parkinon per la PINK1-Parkin-pado.Kompare al niaj BRD4 PDPL-rezultoj, parkina N-finstacio-fuzio rivelis pli grandan aron de celproteinoj, kvankam ĝi kovris pli grandan parton de la C-finaĵo (177 el 210) (Figuro 5a,b kaj Suplementaj Datumoj 4).la rezulto kongruas kun raportoj, ke N-finaj etikedoj povas aberre aktivigi Parkin44.Surprize, estis nur 18 imbrikitaj proteinoj en niaj datumoj kun publikigitaj AP-MS-rezultoj por Parkin43, verŝajne pro diferencoj inter ĉelaj linioj kaj proteomikaj laborfluoj.Krom kvar konataj proteinoj (ARDM1, HSPA8, PSMD14 kaj PSMC3) identigitaj per du metodoj (Fig. 5c)43.Por plue validigi la rezultojn de LC-MS/MS, PDPL-traktado kaj posta okcidenta blotting estis uzataj por kompari la rezultojn de la HEK293T gepatra ĉela provo kaj la stabila N-fina parkinlinio.Antaŭe nekonataj celoj CDK2, DUT, CTBP1, kaj PSMC4 estis provitaj per konata ligilo, DNAJB1 (Fig. 5d).
Vulkanintrigo de parkin-interagaj proteinoj en HEK293T-ĉeloj kun stabile esprimita miniSOG kunfandita al la N- aŭ C-finaĵo de parkino (n = 3 sendependaj biologiaj eksperimentoj).La t-testo de Duvosta Studento estis uzita sur vulkanintrigoj.HEK293T estis uzata kiel negativa kontrolo. Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p < 0.05 kaj > 2-obla jona intensecdiferenco). Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p < 0.05 kaj > 2-obla jona intensecdiferenco). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интосни в интесо). Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p <0.05 kaj >2-obla diferenco en jona intenseco).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионлей ионлей). Signife ŝanĝitaj proteinoj estas elstarigitaj en ruĝa (p <0.05 kaj> 2-obla diferenco en jona forto).Rilataj proteinoj gravaj por HEK293T-miniSOG sed ne gravaj por HEK293T estas montritaj en verdo.b Venn-diagramo montranta imbriktajn proteinojn inter N-finaj kaj C-finaj konstrukcioj.N-finaj etikedoj povas aberre aktivigi parkinon kaj rezultigi pli rekoneblajn proteinojn.c Venn-diagramo montranta imbrikitajn proteinojn inter PDPL kaj AP-MS.Konataj interagantoj estas listigitaj, inkluzive de 4 el 18 imbrikitaj proteinoj kaj 11 el 159 proteinoj specife identigitaj en PDPL.d Reprezentaj celoj identigitaj de LC-MS/MS estis kontrolitaj per okcidenta blotting.e Ssu72 kaj SNW1 estis identigitaj kiel neregistritaj parkinsubstratoj.Tiuj FLAG-etikeditaj proteinplasmidoj estis transfektitaj en HEK293T kaj HEK293T-Parkin-miniSOG sekvitaj per CCCP-traktado ĉe diversaj tempopunktoj.La degenero estis pli okulfrapa en la Parkina troesprimlinio.f Uzante la proteazom-inhibitoron MG132, estis konfirmite ke la degenerprocezo de Ssu72 kaj SNW1 estas mediaciita per proteasome-ubiquitination.Ĉi tiuj eksperimentoj estis sendepende ripetitaj almenaŭ dufoje kun similaj rezultoj.Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.
Precipe, la proteinoj identigitaj fare de PDPL devas inkludi parkin-devigajn proteinojn kaj siajn substratojn.Por detekti neregistritajn parkinsubstratojn, ni elektis sep identigitajn proteinojn (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 kaj SNW1) kaj transfektitajn plasmidojn por elmontri ĉi tiujn genojn al normala HEK293T kaj stabile esprimi la HEK293T de miniSOG-Parkin sekvitan de CCCP-traktado.La niveloj de proteinoj Ssu72 kaj SNW1 estis signife reduktitaj en la stabila linio miniSOG-Parkin (Fig. 5e).Traktado kun CCCP dum 12 horoj rezultigis la plej signifan degeneron de ambaŭ substratoj.Por esplori ĉu la degenero de Ssu72 kaj SNW1 estas reguligita per proteasome-ubiquitination, la proteasome-inhibitoro MG132 estis aldonita por malhelpi proteasome-agadon, kaj fakte ni trovis, ke ilia degradadprocezo estis malhelpita (Fig. 5f).Pliaj ne-substrataj celoj estis konfirmitaj kiel Parkin-interagantoj uzante Okcidentan blotting (Suplementa Fig. 10), kiu montris konsekvencajn rezultojn kun LC-MS/MS.En konkludo, la integriĝo de la PDPL-laborfluo kun celproteina transfekta konfirmo permesas la identigon de neregistritaj E3-ligase substratoj.
Ni evoluigis komunan proksimecmarkadplatformon, kiu ebligas vin identigi en spaco kaj tempo interrilatantaj POI-ojn.La platformo estas bazita sur la miniSOG-fotosensibiliza proteino, kiu estas nur proksimume 12 kDa, malpli ol duono de la grandeco de la matura APEX2-enzimo (27 kDa) kaj unu triono de la grandeco de TurboID (35 kDa).La pli malgranda grandeco devus multe vastigi la vicon da aplikoj por studado de malgrandaj proteininteraktomoj.Plia esplorado de kromaj fotosensibiligiloj, ĉu genetike ĉifritaj proteinoj aŭ malgrandaj molekuloj, estas necesa por pliigi la kvantuman rendimenton de singlet-oksigeno kaj vastigi la sentemon de tiu aliro.Por la nuna versio de miniSOG, alta tempa rezolucio povas esti atingita uzante bluan lumon por aktivigi proksimecsignojn.Krome, pli longa ekspontempo liberigis pli grandan "nubon" de singlet-oksigeno, rezultigante modifon de pli distalaj histidinrestaĵoj, pliigis etikedradiuson, kaj la kapablon fajnagordi la PDPL-spacan rezolucion.Ni ankaŭ testis sep kemiajn enketojn por pliigi la signal-al-fono-proporcion kaj esploris la molekulan mekanismon malantaŭ ĉi tiu aliro.La TOP-ABPP-laborfluo kombinita kun senantaŭjuĝa malferma serĉo konfirmis, ke modifoj okazis nur en histidinoj kaj neniu konsekvenca mikromedio estis observita por pliigitaj histidinmodifoj, krom modera prefero por histidinoj en la bukloregiono.
PDPL ankaŭ estis uzita por karakterizi subĉelajn proteomojn kun proteomspecifeco kaj priraportado minimume komparebla al alia proksimecetikedado kaj organel-specifaj kemiaj enketmetodoj.Proksimaj signoj ankaŭ estis sukcese uzitaj por karakterizi la surfacajn, lizozomajn, kaj sekretom-rilatajn proteomojn46,47.Ni kredas, ke PDPL estos kongrua kun ĉi tiuj subĉelaj organetoj.Krome, ni defiis PDPL identigante celojn por citosola proteina ligado, kiuj estas pli kompleksaj ol membran-ligitaj proteinoj pro siaj dinamikaj propraĵoj kaj implikiĝo en pli tempaj interagoj.PDPL estis aplikita al du proteinoj, la transkripcia kunaktiviganto BRD4 kaj la malsan-rilata ligazo E3 Parkin.Ĉi tiuj du proteinoj estis elektitaj ne nur por siaj fundamentaj biologiaj funkcioj, sed ankaŭ por sia klinika graveco kaj terapia potencialo.Por tiuj du POIoj, konataj devigaj partneroj same kiel neregistritaj celoj estis identigitaj.Precipe, la faza apartig-rilata proteino SFPQ estis konfirmita per ko-IP, kiu povas indiki novan mekanismon per kiu BRD4 (mallonga izoformo) reguligas LLPS.Samtempe, ni kredas, ke la identigo de Parkin-substratoj estas scenaro en kiu la identigo de nerektaj gluoj estas postulata.Ni identigis du neidentigitajn parkinsubstratojn kaj konfirmis ilian degeneron laŭ la ubiquitination-proteasome pado.Lastatempe, mekanismo-bazita kaptada strategio estis evoluigita por detekti hidrolazsubstratojn kaptante ilin kun enzimoj.Kvankam ĉi tio estas tre potenca metodo, ĝi ne taŭgas por la analizo de substratoj implikitaj en la formado de grandaj kompleksoj kaj postulas la formadon de kovalentaj ligoj inter la enzimo kaj la substrato.Ni atendas ke PDPL povas esti etendita por studi aliajn proteinkompleksojn kaj enzimfamiliojn, kiel ekzemple la deubiquitinase kaj metaloprotease familioj.
Nova formo de miniSOG, nomita SOPP3, estis evoluigita kun plibonigita singlet-oksigenproduktado.Ni komparis miniSOG kun SOPP3 kaj trovis plibonigitan markadan rendimenton, kvankam la signalo-bruo-proporcio restis senŝanĝa (Suplementa Fig. 11).Ni hipotezis, ke optimumigo de SOPP3 (ekz., per direktita evoluo) kondukus al pli efikaj fotosensibiligaj proteinoj, kiuj postulas pli mallongajn lumtempojn kaj tiel permesus kapti pli dinamikajn ĉelajn procezojn.Precipe, la nuna versio de PDPL estas limigita al la ĉela medio ĉar ĝi postulas bluan lumon kaj ne povas penetri profundajn histojn.Ĉi tiu trajto malhelpas sian uzon en bestmodelaj studoj.Tamen, la kombinaĵo de optogenetiko kun PDPL povus disponigi ŝancon por bestesplorado, precipe en la cerbo.Krome, aliaj realigitaj infraruĝaj fotosensibilizadoroj ankaŭ forigas ĉi tiun limigon.Esplorado estas nuntempe en ĉi tiu areo.
La HEK293T ĉellinio estis akirita de ATCC (CRL-3216).La ĉellinio testis negativan pri mikoplasma infekto kaj estis kultivita en DMEM (Thermo, #C11995500BT) kompletigita kun 10% feta bova serumo (FBS, Vistech, #SE100-B) kaj 1% penicilino/streptomicino (Hyclone, #SV30010).kreskis en.
3-Aminofenileno (specimeno 3) kaj (4-etinilfenil)metanamino (specimeno 4) estis aĉetitaj de Bidepharm.Propilamino (sondilo 2) estis aĉetita de Energy-chemicals.N-(2-Aminofenil)pent-4-inamido (sondo 1) estis sintezita laŭ publikigitaj metodoj.
Suplementa Tabelo 1 listigas la genetikajn konstruaĵojn uzatajn en ĉi tiu studo.La miniSOG kaj KillerRed-sekvencoj estis klonitaj de donaca plasmido de P. Zou (Pekina Universitato).La mitokondria matrica cela sekvenco estis derivita de la 23 N-finaj aminoacidoj de COX4 kaj klonita en la indikitajn vektorojn uzante Gibson-asembleon (Beyotime, #D7010S).Por celi la membranon kaj nukleon de la endoplasma retikulo, SEC61B homa DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) plifortigita per PCR de cDNA-biblioteko de HEK293T-ĉeloj, kaj H2B DNA (donacita fare de D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) kaj klonita, kiel menciite supre.Krom se alie indikite, aliaj proteingenoj uzitaj por transfekto kaj konstruado de stabilaj ĉellinioj estis PCR plifortigitaj de la HEK293T-ĉela cDNA-biblioteko.G3S (GGGS) kaj G4S (GGGS) estis utiligitaj kiel ligiloj inter la logilproteino kaj miniSOG.V5 epitopetikedo (GKPIPNPLLGLDST) estis aldonita al tiuj fuziokonstruaĵoj.Por esprimo en mamuloj kaj establi stabilan ĉellinion, la miniSOG-fuziokonstruaĵo estis subklonita en la pLX304 lentivirusan vektoron.Por bakteria esprimo, miniSOG estis klonita en la pET21a-vektoron etikeditan 6xHis ĉe la C-finstacio.
HEK293T-ĉeloj estis semitaj je 2.0 x 105 ĉeloj per puto en ses-putaj platoj kaj transfektitaj 24 horojn poste kun rekombinaj lentiviraj plasmidoj (2.4 μg pLX304) kaj viruspakaj plasmidoj (1.5 μg psPAX2 kaj 1.2 μg pMD2. , #C0533), proksimume 80% fuzio.Post nokta transfekto, la medio estis ŝanĝita kaj kovita dum aliaj 24 horoj.La kolekto de la viruso estis farita post 24, 48 kaj 72 horoj.Antaŭ infekto de la celaj ĉellinioj, la virusmedio estis filtrita tra 0.8 μm filtrilo (Merck, #millex-GP) kaj polibreno (Solarbio, #H8761) estis aldonita al koncentriĝo de 8 μg/ml.Post 24 horoj, la ĉeloj estis permesitaj resaniĝi ŝanĝante la medion.Ĉeloj estis elektitaj uzante 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) por la unuaj tri trairejoj kiel pli malalta strikta elekto.Tiam uzis 20 μg/ml kiel pli striktan reĝimon por la sekvaj tri trairejoj.
Ĉeloj estis semitaj en 12-putaj kameroj (Ibidi, numero 81201) je denseco de proksimume 20,000 ĉeloj per puto.Por plibonigi la adheron de HEK293T-ĉeloj, aldonu 50 µg/ml fibronektinon (Corning, #356008) diluitajn en fosfata tamponita salo (PBS, Sangon, #B640435) je 37 °C.La ĉambroj estis antaŭtraktitaj dum 1 horo kaj tiam forigitaj kun PBS.Post 24 h, ĉeloj estis lavitaj unufoje kun PBS, kovataj per 1 mM-sondilo 3 en freŝa ekvilibra salsolvo de Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) dum 1 h je 37 °C, kaj poste kovataj per blua LED (460 nm). ).) estis surradiitaj dum 10 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Post tio, la ĉeloj estis lavitaj dufoje kun PBS kaj fiksitaj kun 4% formaldehido en PBS (Sangon, #E672002) dum 15 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Troa formaldehido estis forigita de fiksaj ĉeloj per lavado trifoje kun PBS.Ĉeloj tiam estis trapenetritaj kun 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) en PBS kaj lavitaj 3 fojojn kun PBS.Tiam forigu la kameron kaj aldonu al ĉiu specimeno 25 µl de klakreaga miksaĵo enhavanta 50 µM Cy3-azido (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) kaj 0,5 mg/ml natria askorbato (Aladdin, n-ro S105024) kaj kovis dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Post rapida reago, ĉeloj estis lavitaj ses fojojn kun PBS enhavanta 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) kaj tiam blokitaj kun 5% BSA (Abcone, #B24726) en PBST dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.
Por kolokaliza imunokolorigo, ĉeloj estis kovataj kun primaraj antikorpoj laŭ la indikitaj kondiĉoj: musa anti-V5-etikedo mAb (1:500, CST, #80076), kuniklo kontraŭ-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), kuniklo policlona kontraŭ-kalneksin antikorpo (1:500, Abcam, numero ab22595) aŭ kuniklo kontraŭ-lamina A/C unuklona antikorpo (1:500; CST, numero 2032) je 4 °C dum la nokto.Post lavi 3 fojojn kun PBST, ĉeloj estis kovataj kun malĉefaj antikorpoj: kapro kontraŭ-kuniklo Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluita 1:1000, kapro kontraŭ-muso Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluita 1:1000.diluo Diluu ĉe ĉambra temperaturo dum 30 minutoj.Ĉeloj tiam estis lavitaj 3 fojojn kun PBST kaj kontraŭmakulitaj per DAPI (Thermo, #D1306) en PBS dum 10 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Post 3 lavoj kun PBS, ĉeloj estis sigelitaj en 50% glicerolo (Sangon, #A600232) en PBS por bildigo.Imunfluoreskaj bildoj estis akiritaj per ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokusa mikroskopo kaj ZNE 3.5-programaro.
Por singlet-oksigena fluoreska bildigo, ĉeloj estis lavitaj dufoje kun Hanks HEPES-bufro antaŭ aldoni 100 nM Si-DMA en Hanks HEPES-bufro (DOJINDO, #MT05).Post eksponiĝo al lumo, la ĉeloj estis kovataj en CO2-inkubatoro je 37 °C dum 45 minutoj.Ĉeloj tiam estis lavitaj dufoje per HEPES-bufro de Hanks kaj kontraŭmakulitaj per Hoechst en HEPES-bufro de Hanks dum 10 minutoj ĉe ĉambra temperaturo kaj bildigitaj per ZEISS LSM 900-konfoka mikroskopo., #M36008) en HBSS-bufro enhavanta kalcion kaj magnezion.Post eksponiĝo al lumo aŭ doxorubicino (MCE, #HY-15142A), ĉeloj estis kovataj en CO2-inkubatoro je 37° C. dum 10 minutoj, lavitaj dufoje kun HBSS-bufro, kaj kovataj kun Hoechst en HBSS-bufro ĉe ĉambra temperaturo.minutoj.Doxorubicin estis uzata kiel pozitiva enketkontrolo kie ĉeloj estis traktitaj kun 20 μM doxorubicin en HBSS enhavanta 1% BSA dum 30 min.Imunfluoreskaj bildoj estis akiritaj per Zeiss LSM 900 konfokusa mikroskopo.
HEK293T-ĉeloj stabile esprimantaj mito-miniSOG estis semitaj je denseco de proksimume 30% en 15 cm pladoj.Post 48 horoj, kiam ~80% kunfluejo estis atingita, la ĉeloj estis lavitaj unufoje kun PBS, kovataj per 1 mM Sondilo 3 en freŝa HBSS-bufro dum 1 horo je 37 °C kaj poste lumigitaj per blua LED dum 10 minutoj ĉe la ĉambro. temperaturo..Poste, la ĉeloj estis lavitaj dufoje kun PBS, skrapitaj kaj resuspenditaj en glacimalvarma PBS-bufro enhavanta EDTA-liberajn proteazajn inhibitojn (MCE, #HY-K0011).Ĉeloj estis lizitaj per sonikado de la pinto dum 1 minuto (1 sekundo enŝaltita kaj 1 sekundo malŝaltita je 35% amplitudo).La rezulta miksaĵo estis centrifugata je 15,871 xg dum 10 minutoj je 4 °C por forigi derompaĵojn, kaj la supernatant-koncentriĝo estis ĝustigita al 4 mg/mL per BCA-proteina analizo-kompleto (Beyotime, #P0009).Kombinu 1 ml de ĉi-supra lisato kun 0,1 mM fotodiserigebla biotina azido (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-Peranto (Aladdin, #T162437), kaj 1 mM CuSO4-inkubatoro kun fundo. rotacio supren dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo.Post rapida reago, aldonu la miksaĵon al la antaŭmiksita solvo (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) en 10 ml vitra fiolo.La specimenoj estis miksitaj kaj centrifugitaj je 4500 g dum 10 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.La malsupraj kaj supraj solvoj estis forĵetitaj, la precipitaĵo estis lavita dufoje per 1 ml da metanolo kaj centrifugata je 15871 × g dum 5 minutoj je 4 °C.Aldonu 1 ml de 8 M ureo (Aladdin, n-ro U111902) en 25 mM amonia bikarbonato (ABC, Aladdin, n-ro A110539) por solvi la precipitaĵon.Provaĵoj estis rekonstruitaj kun 10 mM ditiotreitolo (Sangon, #A100281 en 25 mM ABC) dum 40 minutoj je 55 °C sekvitaj per aldono de 15 mM freŝa jodoacetamido (Sangon, #A600539) ĉe ĉambra temperaturo en la mallumo.Alkilado ene de 30 minutoj..Pliaj 5 mM ditiotreitolo estis aldonitaj por ĉesigi la reagon.Preparu proksimume 100 µl NeutrAvidin-agarozajn bidojn (Thermo, #29202) por ĉiu specimeno lavante 3 fojojn kun 1 ml PBS.La ĉi-supra proteom-solvo estis diluita per 5 ml de PBS kaj kovita kun antaŭlavitaj NeutrAvidin-agarozperloj dum 4 horoj ĉe ĉambra temperaturo.La bidoj tiam estis lavitaj 3 fojojn kun 5 ml PBS enhavanta 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 fojojn kun 5 ml PBS enhavanta 1M ureon, kaj 3 fojojn kun 5 ml ddH2O.La bidoj tiam estis rikoltitaj per centrifugado kaj resuspenditaj en 200 μl de 25 mM ABC enhavanta 1 M ureon, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) kaj 20 ng/μl tripsino (Promega, #V5280).Tripsinigu nokte je 37 °C kun rotacio.La reago estis ĉesigita per aldonado de formika acido (Thermo, # A117-50) ĝis la pH atingis 2-3.La bidoj estis lavitaj 3 fojojn kun 1 ml da PBS enhavanta 0,2% SDS, 3 fojojn kun 1 ml da PBS enhavanta 1 M ureon, kaj tiam 3 fojojn kun 1 ml da distilita akvo.La modifitaj peptidoj estis liberigitaj per malpeza lizo (365 nm) dum 90 minutoj uzante 200 μl de 70% MeOH.Post centrifugado, la supernatante estis kolektita.La bidoj tiam estis lavitaj unufoje kun 100 μl de 70% MeOH kaj la supernatantes estis kunigitaj.Specimenoj estis sekigitaj en vakua koncentrilo Speedvac kaj konservitaj je -20 °C ĝis analizo.
Por identigi kaj kvantigi singlet-oksigenajn modifitajn peptidojn, specimenoj estis resolvitaj en 0.1% formika acido kaj 1 μg da peptidoj estis analizitaj per mas-spektrometro Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ekipita per nano ESI-fonto de Tune kaj Xcalibur de vendista programaro 4.3.Specimenoj estis apartigitaj sur 75 µm × 15 cm interne pakita kapilara kolumno kun 3 µm C18-materialo (ReproSil-pur, #r13.b9.) kaj konektitaj al EASY-nLC 1200 UHPLC-sistemo (Thermo).La peptidoj estis apartigitaj per lineara 95-minuta gradienta kromatografio de 8% solvilo B ĝis 50% solvilo B (A = 0.1% formitacido en akvo, B = 0.1% formitacido en 80% acetonitrilo), tiam linie pliigitaj ĝis 98% B min. en 6 min kun flukvanto de 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos kolektas datumojn alterne inter plena MS-skanado kaj MS2-skanado depende de la datumoj.La ŝpruciga tensio estis fiksita al 2.1 kV kaj la temperaturo de la jontransporta kapilaro estis 320 °C.MS-spektroj (350-2000 m/z) estis kolektitaj kun rezolucio de 120,000, AGC 4 × 105, kaj maksimuma enirtempo de 150 ms.La 10 plej oftaj multobligaj ŝarĝitaj antaŭuloj en ĉiu plena skanado estis fragmentigitaj uzante HCD kun normaligita kolizioenergio de 30%, kvarpola izoliteca fenestro de 1.6 m/z, kaj rezolucia fikso de 30,000.AGC-celo por tandema mas-spektrometrio uzanta 5×104 kaj maksimuman enigtempon 150 ms.La dinamika escepto estas agordita al 30 sekundoj. Neasignitaj jonoj aŭ tiuj kun pagendaĵo de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS. Neasignitaj jonoj aŭ tiuj kun pagendaĵo de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ kaj >7+ были отклонены для МС/МС. Neasignitaj jonoj aŭ jonoj kun pagendaĵo de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nespecifitaj jonoj aŭ jonoj kun pagendaĵoj de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS.
La krudaj datumoj estas prilaboritaj per la komputika platformo FragPipe bazita sur MSFragger.Amasbiasioj kaj ekvivalentaj aminoacidoj estis determinitaj uzante malferman serĉalgoritmon kun antaŭ-mastoleremo de -150 ĝis 500 Da.Modifitaj peptidoj tiam estis identigitaj uzante histidinajn modifojn kun masaj gajnoj de +229.0964 kaj +247.1069 Da en PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ĉeloj stabile esprimantaj la kunfanditan miniSOG-genon estis tegitaj en 6 cm pladoj.Atinginte ~80%-konfluejon, ĉeloj estis lavitaj unufoje per HBSS (Gibco, #14025092), tiam kovataj per kemiaj sondiloj en HBSS dum 1 horo je 37 °C kaj lumigitaj per blua lumo.10W LED dum 20 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.Determini kiu speco de reaktiva oksigena specio estas implikita en PDPL, 0.5 mM-vitamino C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM manitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 estis aldonitaj al la ĉeloj kiel suplementoj.Post lavado per malvarma PBS, ĉeloj estis skrapitaj, kolektitaj en 1.5 ml centrifugiltuboj, kaj sonikataj per pinto dum 1 min en 200 μl da PBS kun 1x proteazo-inhibitoro sen EDTA (1 s kaj 1 s sen, amplitudo 35%).La rezulta miksaĵo estis centrifugata je 15,871 × g dum 10 minutoj je 4 °C kaj la supernatantkoncentriĝo estis ĝustigita al 1 mg/mL per BCA-proteina analizo-kompleto.Proksimume 50 µl de ĉi-supra lisato estis kovataj kun 0.1 mM rodamina azido (Aladdin, n-ro T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA-ligando, kaj 1 mM CuSO4 dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo kun rotacio de malsupre ĝis supro.Post la klaka reago, precipitaĵo kun acetono estis efektivigita aldonante 250 μl da antaŭmalvarmigita acetono al la specimenoj, kovante je -20 °C dum 20 minutoj kaj centrifugante je 6010 × g dum 10 minutoj je 4 °C.Kolektu la buleton kaj boligu en 50 µl de la bufro de 1x Laemmli dum 10 minutoj je 95 °C.Provaĵoj estis tiam analizitaj sur SDS-PAGE longaj ĝeloj kaj bildigitaj uzante la Bio-rad ChemiDoc MP Touch bildigan sistemon kun Image Lab Touch programaro.
Esprimo kaj purigo de la rekombina miniSOG-6xHis-proteino estis faritaj kiel antaŭe priskribite.Mallonge, E. coli BL21 (DE3) ĉeloj (TransGen, #CD701-02) estis transformitaj kun pET21a-miniSOG-6xHis kaj proteina esprimo estis induktita kun 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Post ĉela lizo, proteinoj estis purigitaj uzante Ni-NTA-agarozajn bidojn (MCE, n-ro 70666), dializitaj kontraŭ PBS, kaj stokitaj ĉe –80 °C.
Por antikorp-bazita en vitro-etikeda proksimeco-analizo, miksu 100 μM purigitan miniSOG, 1 mM-sondilon 3, kaj 1 μg kontraŭ-etikedan musan unuklonan antikorpon (TransGen, #HT501-01) en PBS al totala reagvolumeno de 50 μl..La reakcia miksaĵo estis surradiita per blua LED-lumo dum 0, 2, 5, 10 kaj 20 minutoj ĉe ĉambra temperaturo.La miksaĵo estis kovita kun 0.1 mM biotin-PEG3-azido (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA-ligando, kaj 1 mM CuSO4 dum 1 h ĉe ĉambra temperaturo sur suprena mova skuilo.Post rapida reago, aldonu 4x Laemmli-bufferon rekte al la miksaĵo kaj boligu je 95 °C dum 10 minutoj.Specimenoj estis analizitaj sur SDS-PAGE-ĝeloj kaj analizitaj per okcidenta makulado kun streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
Histidin-entenanta sinteza peptido kun C-fina amidado (LHDALDAK-CONH2) kutimis analizi proksiman peptid-bazitan en-vitran etikedadon.En ĉi tiu provo, 100 μM purigita miniSOG, 10 mM-enketo 3 kaj 2 μg/ml sinteza peptido estis miksitaj en PBS en totala reagvolumo de 50 μl.La reakcia miksaĵo estis surradiita per blua LED-lumo dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo.Unu mikrolitro da specimeno estis analizita per LC-MS-sistemo (Akvoj, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mas-spektrometro kun MassLynx-spektro-analiza programaro).
HEK293T-ĉeloj stabile esprimantaj la miniSOG-fuziogenon estis semitaj en 10 cm pladoj por linioj kun malsama organela lokalizo (Mito, ER, Nucleus) kaj 15 cm pladoj por Parkin-miniSOG kaj BRD4-miniSOG-linioj.Atinginte ~90%-konfluejon, la ĉeloj estis lavitaj unufoje per HBSS, tiam kovataj per sondilo 3 en HBSS dum 1 horo je 37 °C kaj lumigitaj per 10 W blua LED ĉe ĉambra temperaturo.Por senkontakta etikedado de Parkin, 10 µM protona karbonilcianida portanto m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) kun enketo 3 en HBSS estis aldonita dum 1 horo je 37 °C.La ĉellizo, klakkemio, redukto kaj alkiligo-ŝtupoj estis la sama kiel priskribite supre, krom ke 2 mg da lisato estis aldonitaj kaj biotina PEG3 azido estis uzita en la klakreago anstataŭe de fotodiserigebla biotina azido.Post riĉiĝo, la bidoj estis lavitaj 3 fojojn kun 5 ml da PBS enhavanta 0.2% SDS, 3 fojojn kun 5 ml da PBS enhavanta 1 M ureon, kaj 3 fojojn kun 5 ml da PBS.Poste, 2 µg de tripsino estis aldonitaj al 300 µl 25 mM ABC enhavanta 1 M ureon por fendi la proteinon dum la nokto je 37 °C.La reago estis ĉesigita per aldonado de formikacido ĝis pH de 2-3 estis atingita.Post tripsinigo sur bidoj, la peptidsolvo estis sensaligita uzante SOLAµ HRP-kolumnon (Thermo, #60209-001) kaj sekigita en Speedvac-vakuokoncentrilo.Peptidoj estis resolvitaj en 0.1% formika acido kaj 500 ng da peptidoj estis analizitaj per mas-spektrometro Orbitrap Fusion Lumos Tribrid ekipita per la nano-ESI-fonto priskribita supre.Peptidoj estis apartigitaj sur komercaj RP-HPLC-antaŭkolumnoj (75 μm x 2 cm) (Thermo, n-ro 164946) kaj analizaj RP-HPLC-kolumnoj (75 μm x 25 cm) (Thermo, n-ro 164941), ambaŭ plenigitaj per 2 μm.gradiento de 8% ĝis 35% ACN en 60 minutoj, tiam linie pliigita al 98% B en 6 minutoj kun flukvanto de 300 Nl/min.MS-spektroj (350-1500 m/z) estis kolektitaj kun rezolucio de 60,000, AGC 4 × 105, kaj maksimuma enirtempo de 50 ms.Elektitaj jonoj estis sinsekve fragmentigitaj per HCD en 3 s-cikloj kun normaligita kolizioenergio de 30%, kvarpola izoliteca fenestro de 1.6 m/z, kaj rezolucio de 15000. 5 × 104 tandema mas-spektrometro AGC-celo kaj maksimuma injektotempo. de 22 ms estis uzataj.La dinamika ekskludo estas agordita al 45 sekundoj. Neasignitaj jonoj aŭ tiuj kun pagendaĵo de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS. Neasignitaj jonoj aŭ tiuj kun pagendaĵo de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ kaj >7+ были отклонены для МС/МС. Neasignitaj jonoj aŭ jonoj kun pagendaĵo de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Nespecifitaj jonoj aŭ jonoj kun pagendaĵoj de 1+ kaj >7+ estis malaprobitaj por MS/MS.
La specimena preparpaŝoj ĝis la riĉigo de la NeutrAvidin-perloj estis la sama kiel en la analizo LC-MS/MS priskribita supre.Proksimume 50 μg da lisato estis uzataj kiel enigo por ŝarĝa kontrolo kaj 2 mg da lisato estis uzataj por klakreagoj.Post riĉiĝo kaj lavado per neŭtravidino, la ligitaj proteinoj estis eluitaj per aldonado de 50 μl da bufro de Laemmli al la agarozaj rezinaj bidoj kaj bolado je 95° C dum 5 minutoj.Kontrola ŝarĝo-enigo kaj perlaj riĉigitaj specimenoj estis analizitaj per SDS-PAGE kaj transdonitaj al PVDF-membranoj (Millipore, #ISEQ00010) per normaj Western blot-metodoj.La membranoj estis blokitaj kun 5% malgrasita lakto (Sangon, #A600669) en TBS enhavanta 0.1% tween-20 (TBST) kaj kovitaj sinsekve kun primaraj kaj sekundaraj antikorpoj.Primaraj antikorpoj estis diluitaj 1:1000 en 5% malgrasita lakto en TBST kaj kovitaj dum la nokto je 4 °C.Sekundaraj antikorpoj estis uzitaj en proporcio de 1:5000 kaj kovataj dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo.La membranoj estis bildigitaj per kemiluminesko uzante la Chemidoc MP bildigan sistemon.Ĉiuj netranĉitaj skanadoj de makuloj kaj ĝeloj en la figuro estas prezentitaj kiel krudaj datumoj.
Primaraj antikorpoj uzitaj en ĉi tiu studo inkludis kuniklo kontraŭ-SFPQ unuklona antikorpo (CST, n-ro 71992), kuniklo kontraŭ-FUS unuklona antikorpo (CST, n-ro 67840), kuniklo kontraŭ-NSUN2 policlona antikorpo (Proteintech, n-ro 20854-1-). AP), kuniklo kontraŭ-mSin3A poliklona antikorpo (Abcam, numero ab3479), musa kontraŭ-etikedo unuklona antikorpo (TransGen, numero HT201-02), musa kontraŭ-β-aktina unuklona antikorpo (TransGen, numero HC201-01), kuniklo kontraŭ -CDK2 unuklona antikorpo (ABclonal, #A0094), kuniklo unuklona antikorpo al CTBP1 (ABclonal, #A11600), kuniklopoliklona antikorpo al DUT (ABclonal, #A2901), kuniklopoliklona antikorpo al PSMC4 (ABclonal, #A2505), kuniklokontraŭkorpo. DNAJB1 poliklona antikorpo (ABclonal, # A5504).Tiuj antikorpoj estis uzitaj je 1:1000 diluo en 5% malgrasita lakto en TBST.La malĉefaj antikorpoj uzitaj en ĉi tiu studo inkludis kontraŭ-kuniklo-IgG (TransGen, #HS101-01), kontraŭ-musan IgG (TransGen, #HS201-01) ĉe 1:5000 diluo.
Por plue esplori ĉu BRD4 interagas kun SFPQ, stabilaj HEK293T kaj BRD4-miniSOG-ĉeloj troesprimantaj HEK293T estis tegitaj en 10 cm pladoj.Ĉeloj estis lavitaj per malvarma PBS kaj lizitaj en 1 ml Pierce IP-lizobufro (Thermo Fisher, #87787) kun EDTA-libera proteazo-inhibitoro dum 30 minutoj je 4 °C.Post tio, la lisatoj estis kolektitaj en 1.5 ml centrifugiltuboj kaj centrifugitaj je 15,871 xg dum 10 minutoj je 4 °C.La supernatante estis rikoltita kaj kovita kun 5 µg da musa monoklona antikorpo (CST, #80076) etikedita kontraŭ-V5 dum la nokto je 4 °C.Lavu proksimume 50 µl de proteino A/G magnetaj bidoj (MCE, #HY-K0202) dufoje kun PBS enhavanta 0.5% Tween-20.Tiam la ĉelaj lisaĵoj estis kovataj per magnetaj bidoj dum 4 horoj je 4 °C kun rotacio de malsupre ĝis supro.Tiam la bidoj estis lavitaj kvar fojojn per 1 ml da PBST-bufro kaj bolitaj je 95 °C dum 5 minutoj.Provaĵoj estis analizitaj sur SDS-PAGE-ĝeloj kaj transdonitaj al PVDF-membranoj uzante normajn Western blot-metodojn.La membranoj estis blokitaj en 5% malgrasita lakto en TBST kaj kovitaj sinsekve kun primaraj kaj sekundaraj antikorpoj.Primara Antikorpa Kuniklo kontraŭ-SFPQ unuklona antikorpo (CST, #71992) estis uzita en proporcio de 1:1000 en 5% malgrasita lakto en TBST kaj kovita dum la nokto je 4 °C.Kontraŭkuniklo IgG estis uzata en proporcio de 1:5000 kaj kovita dum 1 horo ĉe ĉambra temperaturo.La membranoj estis bildigitaj per kemiluminesko uzante la Chemidoc MP bildigan sistemon.
Ĉiuj strukturoj uzitaj por la analizo de Solvent Accessible Surface Area (SASA) estis akiritaj de la Protein Data Bank (PDB)52 aŭ la AlphaFold Protein Structure Database53.Absoluta SASA estis kalkulita por ĉiu restaĵo uzante la FreeSASA-programon.Nur kompletaj kaj malambiguaj SASA-datenoj por etikedita histidino kaj ĝiaj najbaroj estis utiligitaj por akiri la averaĝan SASA por ĉiu strukturo.La relativa solventa alirebleco (RSA) por ĉiu histidino estis kalkulita dividante la absolutan SASA-valoron per la empiria maksimuma ebla restsurfacareo havebla al la solvilo.Ĉiuj histidinoj tiam estis klasifikitaj kiel kaŝitaj se la averaĝa RSA estis sub 20%, alie elmontrita56.
Krudaj dosieroj akiritaj en DDA-reĝimo estis serĉitaj uzante Proteome Discoverer (v2.5) aŭ MSfragger (Fragpipe v15.0) en la taŭga SwissProt kontrolita proteindatumbazo enhavanta oftajn poluaĵojn.La peptidoj postulis kompletan tripsinon kun du mankantaj fendiĝlokoj, carbamoilmetiligon kiel fiksa modifo kaj metioninoksidadon kiel dinamika modifo.Antaŭuloj kaj fragmentaj pezotoleremoj estis fiksitaj al 10 ppm kaj 0.02 Da (MS2 Orbitrap), respektive. Poluaĵaj sukcesoj estis forigitaj, kaj proteinoj estis filtritaj por akiri malveran malkovron de <1%. Poluaĵaj sukcesoj estis forigitaj, kaj proteinoj estis filtritaj por akiri malveran malkovron de <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы полуфи чо 1%. Poluaĵtrafoj estis forigitaj kaj proteinoj filtritaj por doni malveran detektoprocenton de <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены, а белки отфильтрованы для достижеств были удалены 1%. Malpurigaĵoj estis forigitaj kaj proteinoj filtritaj por atingi malveran pozitivan indicon de <1%.Por kvanta analizo sen uzo de etikedoj, normaligita proteinenhavo de tri biologiaj ripetoj estis uzita.Proteina subĉela lokalizanalizo estis farita per Gene Ontology (GO) analizo de DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 kaj datumbazoj kompilitaj kaj publikigitaj de la Alice Ting-grupo.La vulkanmapo estis akirita de Perseo (v1.6.15.0). Proteinaj abundecaj faldŝanĝoj estis provitaj pri statistika signifo per duflanka t-testo, kaj proteino-sukcesoj estis identigitaj kun abundoŝanĝo> 2 (krom se alie dirite) kaj p-valoro <0.05. Proteinaj abundecaj faldŝanĝoj estis provitaj pri statistika signifo per duflanka t-testo, kaj proteino-sukcesoj estis identigitaj kun abundoŝanĝo> 2 (krom se alie dirite) kaj p-valoro <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Proteinenhavaj faldŝanĝoj estis provitaj pri statistika signifo uzante duvostan t-teston, kaj proteinaj matĉoj estis identigitaj kun enhavŝanĝo> 2 (krom se alie notite) kaj ap-valoro <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有） 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 p 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Statistika signifo de faldaj ŝanĝoj en proteina enhavo estis provita per duvosta t-testo, kaj protein-matĉoj estis determinitaj por enhavaj ŝanĝoj > 2 (krom se alie indikite) kaj p-valoroj <0.05.Proteina interaganalizo estis farita uzante GO-analizon kune kun la String-datumbazo.
Tri biologiaj kopioj estis faritaj kun similaj rezultoj.Statistika analizo estis farita per GraphPad Prism (GraphPad-programaro) kaj vulkanintrigoj estis generitaj kun Perseo (v1.6.15.0).Por kompari la du grupojn, p-valoroj estis determinitaj per duvosta Studenta t-testo.Nur unuopaj proteinoj identigitaj almenaŭ dufoje en la eksperimenta grupo estis inkluditaj en la vulkanintrigoj, kaj la respondaj mankantaj valoroj en la kontrolgrupo estis anstataŭigitaj per Perseo el normala distribuo por ke la p-valoro povus esti kalkulita.Eraraj stangoj reprezentas la meznombran ± norman devion.En proteomaj analizoj por statistika analizo, la abundo de proteinoj kiuj aperis en almenaŭ du biologiaj kopioj estis retenita.Statistikaj metodoj ne estis uzataj por antaŭdetermini la specimenan grandecon.La eksperimentoj ne estas hazardaj.La esploristoj ne estis blindaj al la taskoj dum la eksperimento kaj taksado de la rezultoj.
Por pliaj informoj pri studdezajno, vidu la abstraktaĵon pri Natura Esplora Raporto ligita al ĉi tiu artikolo.
La mas-spektrometriaj datumoj akiritaj en ĉi tiu studo estis prezentitaj al la ProteomeXchange Konsorcio per la partnera deponejo iProX57 sub datumaro ID PXD034811 (PDPL-MS-datumaro).Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.Ĉi tiu artikolo provizas la originajn datumojn.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Konatiĝi kun la najbareco: uzante proksimec-dependan biotiniladon por karakterizi proteinkompleksojn kaj mapi organetojn. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Konatiĝi kun la najbareco: uzante proksimec-dependan biotiniladon por karakterizi proteinkompleksojn kaj mapi organetojn.Gingras, AS, Abe, KT kaj Raut, B. Konateco kun medio: uzante proksimec-dependan biotiniladon por karakterizi proteinkompleksojn kaj mapi organetojn. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并绘合物并绘绘剩并绘 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Komprenante la najbarecon: uzu la dependecon de la najbareco de biologia vivo.Gingras, AS, Abe, KT kaj Raut, B. Komprenante proksimecon: karakterizado de proteinkompleksoj kaj mapado de organetoj uzantaj proksimec-dependan biotinilation.Nuna.Mia opinio.Kemiaĵo.biologio 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Mapante la mikromedion transdonante Dexter-energion al imunĉeloj.Scienco 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.Du-proteomaj skalretoj detektas ĉel-specifan restrukturadon de la homa interaktomo.Ĉeloj 184, 3022–3040.e3028 (2021).