Novaĵoj

Dankon pro vizito de Nature.com.La retumila versio, kiun vi uzas, havas limigitan CSS-subtenon.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Intertempe, por certigi daŭran subtenon, ni redonos la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Kanceraj ĉeloj evoluis diversajn mekanismojn por venki ĉelan streson kaj daŭre progresi.Proteinkinazo R (PKR) kaj ĝia proteinaktiviganto (PACT) estas la komencaj respondantoj kiuj monitoras diversajn stressignalojn kondukantajn al inhibicio de ĉelmultobliĝo kaj apoptozo.Tamen, la reguligo de la PACT-PKR-pado en kanceraj ĉeloj restas plejparte nekonata.Ĉi tie, ni trovis, ke longa ne-koda RNA (lncRNA) aspartil tRNA sintetazo kontraŭsensa RNA 1 (DARS-AS1) estas rekte implikita en la inhibicio de la PACT-PKR-vojo kaj antaŭenigas kancerĉelan proliferadon.Uzante grandskalan funkcian ekzamenadon de CRISPRi 971 kancer-rilata lncRNA, ni trovis, ke DARS-AS1 estis asociita kun signife plifortigita kancerĉela proliferado.Tial, DARS-AS1-knokaŭto malhelpas ĉelan proliferadon kaj antaŭenigas kancerĉelan apoptozon en diversaj kancerĉelaj linioj en vitro kaj signife reduktas tumorkreskon en vivo.Meĥanike, DARS-AS1 ligas rekte al la PACT-aktivigdomajno kaj malhelpas PACT-PKR-interagadon, tiel reduktante PKR-aktivigon, eIF2α-fosforiligo, kaj malhelpante apoptotan ĉelmorton.Klinike, DARS-AS1 estas vaste esprimita en multoblaj kanceroj, kaj troesprimo de tiu lncRNA estas indika de malbona prognozo.Ĉi tiu studo pliklarigas kancer-specifan reguligon de la PACT-PKR-pado de DARS-AS1-lncRNA kaj disponigas alian celon por kancerprognozo kaj terapio.
La kapablo adaptiĝi al streso estas grava karakterizaĵo de kancerĉela supervivo kaj proliferado.La rapida proliferado kaj metabolaj signoj de kancero pintas en severaj mikromedioj - nutra senigo, hipoksio kaj malalta pH - kiuj povas ekigi ĉelmortajn signalajn vojojn.Malregulado de stres-sentemaj genoj kiel p535, varmoŝoko-proteinoj 6, 7, KRAS8, 9, kaj HIF-110, 11, 12, 13 estas ofte observita en kancero, tiel blokante apoptozon kaj antaŭenigante supervivon.
Proteinkinazo R (PKR) estas grava stressensilo kaj subunua kinazo de eŭkariota inicfaktoro 2α (eIF2α), traduka reguligisto kiu ligas ĉelan streson al ĉelmorto.PKR estis origine identigita kiel kontraŭvirusa proteino per la detekto de fremda duoble-senhelpa RNA (dsRNA).Post aktivigo, PKR fosforilas eIF2α por malhelpi virusan kaj ĉelan proteinsintezon14,15,16.PACT (PKR-aktivigproteino) estis identigita kiel la unua PKR-aktivigproteino en la foresto de dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Tra rekta interagado kun PKR, PACT transduktas diversajn stresojn (serummalsato, peroksido aŭ arsenittraktado) al PKR kaj kontraŭfluaj signalaj vojoj.Krom eIF2α-fosforiligo, PACT-mediaciita PKR-aktivigo ekigas diversajn eventojn asociitajn kun la streĉa respondo, inkluzive de ŝanĝita redox-statuso per la vojo PI3K/Akt24, plibonigita DNA-difekto-kontrolado per p5325,26 kaj NF-κB27,28 Reguligas transskribon, 29. Konsiderante ilian kritikan rolon en stresrespondo, proliferado, apoptozo kaj aliaj ŝlosilaj ĉelaj procezoj, PKR kaj PACT promesas terapiajn celojn por multaj malsanoj, precipe kancero30,31,32,33.Tamen, malgraŭ tiu pleiotropa funkcia kaj biologia signifo, la reguligo de PACT/PKR-agado en kanceraj ĉeloj restas pasema.
LncRNAoj estas transskribaĵoj pli grandaj ol 200 nukleotidoj kun neniu protein-ĉifrada potencialo.Ĉar avangardaj tutaj genarsekvencaj projektoj identigis milojn da lncRNA-oj,35,36 multe da klopodo estis farita por pliklarigi iliajn biologiajn funkciojn.Kreskanta aro de esplorado montris, ke lncRNA-oj estas implikitaj en multaj biologiaj procezoj37 inkluzive de la reguligo de X-kromosoma malaktivigo38,39, impreso40, transskribo41,42, traduko43 kaj eĉ kancerkresko44,45,46,47.Tiuj studoj raportis ke multaj lncRNAoj estas implikitaj en la PACT/PKR-pado.Unu tia studo montris ke lncRNA ASPACT malhelpis PACT-transskribon kaj pliigis atomretenon de PACT-mRNA.Aliaj studoj montris, ke lncRNA nc886 ligas al PKR kaj malhelpas ĝian fosforiligon49,50.Ĝis nun, lncRNA reguliganta PACT-mediaciitan PKR-aktivigon ne estis raportita.
Aspartyl-tRNA sintetazo kontraŭsensa RNA 1 (DARS-AS1) estis identigita kiel onkogena lncRNA51,52,53,54.Tra la reguligo de miP-194-5p53, miP-12952 kaj miP-532-3p51, DARS-AS1 pruviĝis antaŭenigi la kreskon de klara ĉela rena ĉelkarcinomo, tiroidkarcinomo kaj ne-malgrandĉela pulma karcinomo, respektive.Tong kaj kolegoj ankaŭ trovis, ke DARS-AS1 antaŭenigas mielomprogresadon konservante la stabilecon de la proteino 39 (RBM39) RNA-liganta ĉeftemo.Tamen, neniuj studoj estis faritaj sur ĉu tiu lncRNA estas implikita en la reguligo de PACT-PKR-aktivigo kaj la stresrespondo de kanceraj ĉeloj.
Ĉi tie, ni faris grandskalan perdo-de-funkcian ekranon uzante la CRISPRi-sistemon kaj determinis, ke DARS-AS1-lncRNA antaŭenigas la proliferadon de pluraj specoj de kanceraj ĉeloj.Krome, ni identigis gravan mekanismon: DARS-AS1 ligas rekte al PACT, malhelpas PACT kaj PKR-ligon, malhelpas fosforiligon de eIF2α, pli malalta PKR-substrato, kaj finfine malhelpas apoptotan ĉelmorton.Konklude, nia laboro malkaŝas la DARS-AS1-lncRNA kiel reguliganton de la PACT-PKR-vojo kaj ebla celo por kancero-traktado kaj prognozo.
Ampleksaj genomaj profilstudoj identigis centojn da lncRNA'oj asociitaj kun kancero.Tamen ilia funkcio restas plejparte nekonata56.Por identigi esperigajn lncRNA-kandidatojn implikitajn en kancero-progresado, ni elfaris perdo-de-funkcian ekranon por reduktita proliferado en la SW620-kolorekta kancera ĉellinio uzante la CRISPRi-sistemon (Fig. 1a).La unika trajto de la SW480 kaj SW620 kojlokancero ĉellinioj estas ke ili estas derivitaj de primaraj kaj sekundaraj tumoroj en ununura paciento.Ĉi tio disponigas valoran komparon por studi genetikajn ŝanĝojn en la progresado de progresinta kojlokancero.Sekve, ni analizis la transcriptomojn de kolorektaj kanceraj ĉellinioj (SW480 kaj SW620) uzante RNA-sekvencon kaj kolektis iujn eblajn funkciajn lncRNA-ojn el la publikigita literaturo.Surbaze de ĉi tiuj rezultoj, ni desegnis kunigitan sgRNA-bibliotekon enhavantan 7355 sgRNA-oligojn celantajn 971 kancer-rilatajn lncRNA-ojn kaj 500 necelajn sgRNA-oligojn por negativa kontrolo (Suplementaj Datumoj 1).
Skema reprezentado de rastrumo uzante la CRISPRi-sistemon.b sgRNA-riĉigo post ekzamenado.La horizontala punktlinio reprezentas log2 (falda ŝanĝo) = ±0.58.La vertikala punktlinio indikas p valoro = 0.05.Nigraj punktoj reprezentas ne-celan sgRNA (nomumita kiel NC).Ruĝaj punktoj estas sgRNA'oj celantaj DARS-AS1.Bluaj punktoj estas sgRNA'oj celantaj LINC00205, antaŭe priskribitan onkogenan lncRNA.faldŝanĝo = (normaligita legado, tago 17)/(normaligita legado, tago 0).c DARS-AS1-sgRNA-knockdown malhelpis ĉelkreskon.Eraraj stangoj reprezentas ± norman devion de la tri eksperimentoj.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 Duvosta Studenta t-testo.d DARS-AS1-esprimo en tumoroj (TCGA-datumserio).em Esprimo de DARS-AS1 en parigitaj normalaj kaj tumoraj specimenoj de pacientoj kun BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP kaj COAD, respektive (TCGA-datumaro).p-valoroj estis akiritaj per la t-testo de parigita duvosta Studento.
Post konstruo de la plasmido kaj enpakado de la lentiviruso, ni transduktis la dCas9-SW620-koloraktan kanceran ĉellinion per la supra biblioteko en kvar sendependaj infektaj eksperimentoj.La obleco de infekto (MOI) por tiuj infektoj estis 0.1-0.3, indikante ke ĉiu ĉelo povas nur esti transfektita kun unu sgRNA.Post 18 tagoj da en vitro-kulturo, la riĉiga profilo de celaj sgRNA-oj malpliiĝis aŭ pliiĝis post kribrado, dum la nombro da ne-celitaj kontrolaj oligonukleotidoj restis relative senŝanĝa kompare kun la antaŭkribra profilo, indikante, ke nia celo havas tre ekranspecifan. biblioteko.Rizo.1b kaj suplementa tabelo 1). LINC00205, kiu antaŭe estis raportita antaŭenigi pulmon-kancero kaj hepatan kancero-progresadon58,59,60, estis elmontrita (log2 (faldŝanĝo) <-0.58, p valoro <0.05), konfirmante la fidindecon de ĉi tiu kribrado (Fig. 1b). LINC00205, kiu antaŭe estis raportita antaŭenigi pulmon-kancero kaj hepatan kancero-progresadon58,59,60, estis elmontrita (log2 (faldŝanĝo) <-0.58, p valoro <0.05), konfirmante la fidindecon de ĉi tiu kribrado (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, antaŭe raportita antaŭenigi la progresadon de pulmo-kancero kaj hepata kancero58,59,60, estis ekskludita (log2 (falda ŝanĝo) <-0.58, p-valoro <0.05), konfirmante la fortikecon de ĉi tiu kribrado (Fig. .1b) . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 了 该 筛选 可靠性 （图 1B）。）） 图 图 1B））） 图 图 图 1B））） 图 图 1B）） 图 1B） 图 图 1B） 图 1B） 1B） 图 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1b） 1b）） 1b） 1b）） 1b） 1b）） 1b）））. LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 （（log2 （倍数 变化） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 了 该 筛选 可靠性 （图 1B）。）） 图 图 1B））） 图 图 图 1B））） 图 图 1B）） 图 1B） 图 图 1B） 图 1B） 1B） 图 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1B） 1b） 1b）） 1b） 1b）） 1b） 1b）） 1b）））. LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, antaŭe raportita antaŭenigi pulmon kaj hepatan kanceran progresadon58,59,60, estis ekskludita (log2 (falda ŝanĝo) <-0.58, p-valoro <0.05), konfirmante la fortikecon de ĉi tiu kribrado (Fig. .1b).
Inter ĉiuj lncRNA-oj testitaj, DARS-AS1 ankaŭ estis ekzamenita, kun la tri parencaj sgRNA-oligonukleotidoj signife reduktitaj post 18 tagoj da kulturo, sugestante ke knockdown de ĉi tiu lncRNA rezultigis reduktitan kanceran proliferadon (Fig. 1b).Ĉi tiu rezulto estis plu subtenata de MTS-analizo en kolorektaj kanceraj ĉeloj montrante, ke la kreskorapideco de DARS-AS1-knockdown-ĉeloj estis nur duonigita kompare kun kontrolĉeloj (Figuro 1c) kaj estis kongrua kun antaŭaj raportoj de pluraj aliaj kanceraj tipoj.: klarĉela rena kancero, tiroida kancero kaj ne-malgrandĉela pulma kancero51,52,53,55.Tamen, ĝia funkcio kaj molekulaj mekanismoj en kolorekta kancero restas neesploritaj.Tial ni elektis ĉi tiun lncRNA por plia studo.
Por studi DARS-AS1-esprimon en pacientoj, ni amplekse analizis 10,327 tumorajn specimenojn de la projekto de Cancer Genome Atlas (TCGA).Niaj rezultoj montras, ke DARS-AS1 estas vaste esprimita kaj signife plialtigita en sanaj ĉeloj en diversaj tumoroj, inkluzive de kolonadenokarcinomo (COAD), rena klara ĉela karcinomo (KIRC), kaj rena papilara ĉela karcinomo (KIRP)..Tre malmultaj (Fig. 1d kaj Suplementa Fig. 1a, b). Analizo de parigitaj sanaj/tumorprovaĵoj plue konfirmis signife pli altan esprimon de DARS-AS1 en la tumoroj de vezika urotelia karcinomo (BLCA), rena rena klara ĉela karcinomo (KIRC), prostata adenokarcinomo (PRAD), pulma skvama ĉela karcinomo (LUSC) , uterina korpusa endometria karcinomo (UCEC), pulma adenokarcinomo (LUAD), hepata hepatoĉela karcinomo (LIHC), rena rena papilara ĉela karcinomo (KIRP), kaj kojla adenokarcinomo (COAD) (p-valoro < 0.05) (Fig. 1e-m) . Analizo de parigitaj sanaj/tumorprovaĵoj plue konfirmis signife pli altan esprimon de DARS-AS1 en la tumoroj de vezika urotelia karcinomo (BLCA), rena rena klara ĉela karcinomo (KIRC), prostata adenokarcinomo (PRAD), pulma skvama ĉela karcinomo (LUSC) , uterina korpusa endometria karcinomo (UCEC), pulma adenokarcinomo (LUAD), hepata hepatoĉela karcinomo (LIHC), rena rena papilara ĉela karcinomo (KIRP), kaj kojla adenokarcinomo (COAD) (p-valoro < 0.05) (Fig. 1e-m) .Analizo de parigitaj sanaj/tumorprovaĵoj ankaŭ konfirmis signife pli altan esprimon de DARS-AS1 en vezika urotelia karcinomo (BLCA), klara ĉela rena kaj rena ĉela karcinomo (KIRC), prostata adenokarcinomo (PRAD), pulma skvama ĉela karcinomo (LUSC) tumoroj., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , endometria karcinomo de la utero (UCEC), adenokarcinomo de la pulmo (LUAD), hepatoĉela karcinomo de la hepato (LIHC), papilara ĉelkarcinomo de la reno (KIRP), kaj adenokarcinomo de la dupunkto (COAD) (p-valoro < 0,05) (Fig. 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (Prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 （（UCEC） ， 肺腺癌 （luad） ， 肝肝 （（lihc） ， 肾 肾 细胞癌 （kirp） 和结肠腺癌 （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (Prad) 、 细胞癌 细胞癌(LUSC) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 癌 （（Ucel） 肺腺癌 （luad） 肝肝 细胞癌 （lihc） 肾 乳头状 细胞 细胞 （（（（（（（（（细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Analizo de sanaj/tumoraj parigitaj provaĵoj plue subtenis la rolon de DARS-AS1 en vezika urotelia karcinomo (BLCA), klarĉela rena ĉela karcinomo (KIRC), prostata adenokarcinomo (PRAD), kaj pulma skvama ĉela karcinomo (LUSC) tumoroj.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). esprimo en korpusa uterina karcinomo (UCEC), pulma adenokarcinomo (LUAD), hepatoĉela karcinomo (LIHC), rena papilara ĉela karcinomo (KIRP), kaj kolonadenokarcinomo (COAD) (p-valoro <0.05) (Figuro 1e -m).Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj indikas, ke DARS-AS1 estas vaste kaj alte esprimita en diversaj kanceroj.
Ĉar DARS-AS1 kaj DARS (la geno kodanta la kontraŭsensan fadenon) dividas la saman iniciatinton kaj situas unu apud la alia, ni desegnis shRNA por specife renversi DARS-AS1 sed ne DARS (Suplementa Fig. 2a,b kaj Suplementa Tabelo 2) .Krom SW620, ni ankaŭ uzis tri aliajn ĉelliniojn alte esprimantajn DARS-AS1 por studi la efikecon kaj funkcion de shRNA-frapo (Kuldona Tablo 3).Niaj rezultoj indikis, ke ĉiuj tri shRNA-oj disvolvitaj atingis almenaŭ 80%-an efikon de DARS-AS1 kun malmulta efiko al la kvanto de DARS-mRNA (Suplementa Fig. 2c-f).Krome, ni trovis, ke DARS-AS1-knockdown kun ĉi tiuj shRNA-oj signife malhelpis ĉelan kreskon en kolorekta kancero ĉellinioj SW620 (49.7%) kaj HCT116 (27.7%), mamkancera ĉellinio MBA-MD-231 (53.4%).) kaj la HepG2-hepatoma ĉellinio (92.7% redukto), same kiel ilia kapablo formi neankritajn sferojn (averaĝa redukto de ~50.8%, 44.6%, 40.7% kaj 75.7% per ĉellinio) (Fig. 2a,b).En SW620, la rezultoj de la provo de formado de kolonio plu konfirmis, ke DARS-AS1-shRNA signife malhelpis ĉelan proliferadon kun averaĝa malkresko de proksimume 69.6% (Fig. 2c).
Efiko de kontrolo-shRNA kaj DARS-AS1-shRNA sur ĉelproliferado (a) kaj sferoida formado (b) en SW620, HCT116, MBA-MD-231, kaj HepG2-ĉeloj.c Efiko de kontrolo-shRNA kaj DARS-AS1-shRNA sur koloniformado en SW620-ĉeloj.Ĉelmultobliĝo (d), sferoida formado (e), kaj kolonioformado (f) de SW620-ĉeloj troesprimante DARS-AS1.Datenoj montritaj estas la meznombro ± norma devio de tri eksperimentoj.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, kaj *** p ≤ 0,001 per duvosta Studenta t-testo.
Por kompletigi studojn pri perdo-de-funkcio, ni poste kreis SW620-ĉelojn superesprimajn DARS-AS1 (Suplementa Fig. 2g).DARS-AS1-troesprimo signife pliigis ĉelkreskon (1.8-obla), neankrita sferoida formado (1.4-obla), kaj kolonia formado (3.3-obla) en SW620-ĉeloj (Fig. 2d-f).Ni konfirmis ĉi tiun rezulton per alia DARS-AS1 esprimanta ĉellinion, A549.Ĉi tiu plifortigita ĉela proliferado pro DARS-AS1-troesprimo estis plue observita en A549-ĉeloj (Suplementa Fig. 2h, i kaj Suplementa Tabelo 3).Kunigitaj, ĉi tiuj studoj pri gajno kaj perdo pruvas, ke DARS-AS1 antaŭenigas la proliferadon de kanceraj ĉeloj en vitro.
Por esplori la suban mekanismon per kiu DARS-AS1 reguligas ĉelan proliferadon, ni faris RNA-tiran analizon por identigi ĝiajn eblajn protein-ligajn partnerojn.RT-qPCR-rezultoj montris, ke ĉirkaŭ 86.2% de DARS-AS1 situas en la citoplasmo de SW620-ĉeloj (Suplementa Fig. 3a).La en vitro transskribita biotinilateita DARS-AS1 aŭ pseŭdoRNA tiam estis kovata kun SW620-ĉellizatoj sekvitaj per SDS-PAGE apartigo.Posta arĝenta makulo montris, ke klara bando (~ 38 kDa) estis signife riĉigita en DARS-AS1-tiraj specimenoj sed ne en imitaĵaj RNA aŭ bidaj specimenoj (Fig. 3a).Ĉi tiu bando estis identigita kiel PKR-aktiviga proteino (PACT) per mas-spektrometrio (MS) kaj plue konfirmita per immunoblotting en ĉellinioj SW620, HCT116 kaj HepG2 (Fig. 3a,b).La riĉigo de DARS kaj rilataj PACT-proteinoj - PKR kaj TRBP - ankaŭ estis esplorita uzante RNA-analizon per okcidenta makulado (WB).La rezultoj indikis, ke neniu rekta interago inter DARS-AS1 RNA kaj ĉi tiuj tri proteinoj estis trovita (Suplementa Fig. 3b).La specifa interago inter DARS-AS1 kaj PACT estis plue konfirmita per RNA-imunoprecipitado (RIP) analizo, kiu montris, ke DARS-AS1 estis signife riĉigita en kontraŭ-PACT-antikorpoj sed ne aliaj kontrolaj RNAoj (Figuro 3c).Por determini ĉu DARS-AS1 interagas rekte kun PACT en la foresto de iuj aliaj ĉelaj komponentoj, en vitro biotavola interferometrio (BLI) analizo estis farita uzante purigitan PACT.Biotin-etikedita DARS-AS1 aŭ imitaĵo RNA estis senmovigita sur streptavidin (SA) biosensiloj kaj tiam kovitaj en kineta bufro enhavanta 1 μM PACT.Precipe, PACT forte ligis al DARS-AS1 (KD-valoro ~26.9 nM), sed ne por imiti RNA (Figuro 3d).Kune, ĉi tiuj rezultoj montras rektan interagadon kaj altan afinecon inter DARS-AS1 kaj PACT.
RNA-tiranalizo identigis DARS-AS1 interagante kun PACT en SW620-ĉeloj.Supre, arĝenta makulo de rilataj proteinoj.Pli malaltaj imunblots estis faritaj kun kontraŭ-PACT-antikorpo.b RNA-tirila analizo estis farita en HCT116 (supro) kaj HepG2 (malsupraj) ĉeloj.PACT-riĉigo estis detektita per imunobrigo.cRNA-imunoprecipitado (RIP) analizoj estis faritaj en SW620-ĉeloj uzante la indikitajn antikorpojn.d PACT-ligaj kurboj al plenlongaj DARS-AS1 aŭ kontrola RNA estis akiritaj per biotavola interferometrio (BLI).RNA estis senmovigita sur streptavidin-biosensilo.1 μM PACT estis uzata por mezuri asocion.La RNA-tira analizo estis farita uzante biotinilate plenlongan DARS-AS1 aŭ detranĉitan (supre).Immunoblot montranta PACT ricevitan (funde).f Purigita markita PACT estis kovata kun biotinilata plenlonga DARS-AS1 aŭ detranĉita (kiel en e) por en vitro RIP-analizo.La ĉerpita RNA estis kontrolita per RT-qPCR.g La relativa afineco de malsamaj RNA-fragmentoj por PACT estis akirita per biotavola interferometrio.Por analizo, 100 nM RNA kaj 1 μM RAST estis uzitaj.h In vitro RIP-analizoj estis faritaj uzante purigitan sendifektan aŭ detranĉitan etikeditan PACT.La ĉerpita RNA estis kontrolita per RT-qPCR.i Kreskofrekvenco de SW620-ĉeloj troesprimante DARS-AS1, PACT, aŭ ambaŭ.j Troesprimo de plenlonga aŭ stumpigita DARS-AS1 en SW620-ĉeloj havis malsamajn efikojn al ĉelkresko.k Apoptozo estis detektita per imunblotado kun anti-PARP-antikorpo.l Knokaŭto de DARS-AS1 induktas apoptozon de SW620-ĉeloj kiel montrite per fluocitometrio.Datenoj montritaj estas la meznombro ± norma devio de tri eksperimentoj. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, per duvosta Studenta t-testo. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, per duvosta Studenta t-testo. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 per duvosta Studenta t-testo. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 per duvosta Studenta t-testo.
Ni tiam generis tri biotinilatajn DARS-AS1 RNA-fragmentojn per envitra transskribo por identigi la DARS-AS1-regionon necesan por PACT-asocio (Figuro 3e).La RNA-analizaj rezultoj montris, ke ĉiu fragmento povis interagi kun PACT, sed la 3′-fina regiono (384-768 nukleotidoj etikeditaj A3) montris pli ol 1-384 nukleotidojn etikeditajn A1) (Fig. 3e).Similaj rezultoj estis observitaj en la in vitro RIP-analizo uzante rekombinan PACT (Figuro 3f).Konsekvence kun tiuj rezultoj, eksperimentoj por ligi senmovigitajn RNA-fragmentojn al PACT uzanta BLI ankaŭ montris ke PACT havas pli altan afinecon por A3 (384-768 nt) (KD-valoro de proksimume 94.6 nM), dum preskaŭ neniuj ligoj kun aliaj areoj.(Fig. 3d).
Ni ankaŭ ekzamenis la rilatajn ligajn regionojn en PACT.PACT enhavas tri funkciajn domajnojn, du el kiuj estas konservitaj duoble-senhelpaj RNA-devigaj domajnoj (dsRBD) kaj tria domajno (nomumita D3) kiu funkcias kiel aktiviganto de proteininteragoj.Por ekzameni la lncRNA-ligan kapaciton de ĉiu domajno, ni realigis tri mutaciojn, kiuj forigis ĉiun el la tri domajnoj kaj faris en vitro RIP-analizon.Niaj rezultoj montris, ke forigo de la tria domajno (D3) de PACT signife reduktis ĝian interagon kun DARS-AS1 (je 0,11-oble kompare kun nerompita PACT) kompare kun la aliaj du mutacioj (Fig. 3h), estis montrite, ke la liberigo. de D3 interagis kun DARS.-AK1.Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke interago inter DARS-AS1 kaj PACT povas okazi ĉefe tra la 3′ fino de DARS-AS1 kaj la D3-domajno de PACT.
Ni rimarkis, ke DARS-AS1 havis neniun efikon al PACT-esprimo kaj PACT havis neniun efikon al DARS-AS1 (Suplementa Fig. 3c).Ni tiam ekzamenis la efikon de PACT-frapo sur ĉela kresko.Kontraste al DARS-AS1, relativaj ĉeloj kreskis 1.5-3 fojojn pli rapide kiam PACT estis terenbatita (Suplementa Fig. 3d).La rezultoj de la provo de formado de kolonioj indikis, ke la ĉeloj formis 2-3-oblajn koloniojn post shRNA-traktado kun PACT (Suplementa Fig. 3e).Por provi ĉu DARS-AS1 reguligas ĉelan proliferadon per PACT, ni generis SW620-ĉelojn superesprimajn PACT, DARS-AS1 aŭ ambaŭ.Troesprimo de PACT montris signifan inhibicion de ĉela proliferado (Figuro 3i).Dum DARS-AS1-troesprimo en si mem signife antaŭenigis ĉelan proliferadon, ekzistis neniu signifa diferenco en la kreskorapideco de ĉeloj troesprimanta DARS-AS1 kaj PACT.Tiuj rezultoj indikas ke PACT povas kontraŭagi la pliigitan proliferadon kaŭzitan de DARS-AS1-troesprimo.
Ĉar malsamaj regionoj de DARS-AS1 havas malsamajn PACT-ligajn kapablojn, ni esploris ilian relativan influon sur ĉela proliferado per malsama troesprimo de DARS-AS1-fragmentoj.Kompare kun la aliaj du fragmentoj, DARS-AS1 estis troesprimita ĉe la 3′ fino (384-768 nt), la ĉefa PACT-rilata regiono en DARS-AS1, kiu havis la plej altan kapablon stimuli ĉelan proliferadon (Fig. 3j).Ĉi tiuj rezultoj indikas pozitivan korelacion inter la liga kapacito kaj biologia funkcio de DARS-AS1.
PACT estis raportita esti por-apoptota proteino19.Tial ni esploris la efikon de DARS-AS1 sur apoptozo.Kiel atendite, DARS-AS1 knockdown signife pliigis PARP-fendon en SW620-ĉeloj kaj pliigis la proporcion de anexin V-pozitivaj ĉeloj en SW620, HCT116, HepG2, kaj MBA-MD-231 ĉellinioj (Fig. 3k).3).3f-h), indikante ke la kontraŭ-apoptoza efiko de DARS-AS1 en kanceraj ĉeloj estas kontraŭa al la apoptoz-induktanta funkcio de PACT.Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj sugestas, ke la mekanismo de DARS-AS1-onkogena funkcio povas esti per inhibicio de PACT-funkcio.
Poste, ni esploris la funkciajn implicojn de la asocio DARS-AS1-PACT.PACT estis raportita aktivigi PKR per rekta interagado, kiu poste plifortigas eIF2α-fosforiligon, kaŭzante tradukan forigon kaj apoptozon17.Unue, ni ekzamenis ĉu DARS-AS1 influas la ĉelan lokalizon de PACT kaj PKR.Konfoka fluoreskecmikroskopio montris ke PACT kaj PKR estis tre kolokigitaj en SW620-ĉeloj kun meza Pearson-korelaciokoeficiento de 0.72.Dume, DARS-AS1-troesprimo signife reduktis PACT kaj PKR-ko-lokigon (meza Pearson-korelacia koeficiento 0.61) (Figuro 4a).Por esplori ĉu DARS-AS1 povus moduli la PACT-PKR-interagon, ni faris ko-immunoprecipitation (ko-IP) provon kun kontraŭ-PACT-antikorpo en SW620-ĉelaj lisatoj.PKR estis tre riĉigita en kontraŭ-PACT en kontrolĉeloj, dum PKR-reakiro estis signife reduktita en lisates de ĉeloj troespresantaj DARS-AS1 (Fig. 4b).Purigitaj etikeditaj PACT kaj PKR estis uzitaj por en vitro-proteinaj ligaj analizoj.Sekve, tiuj, kiuj provizis DARS-AS1 sed neniu kontrola RNA, montris subpremitan PACT-PKR-interagon (Figuro 4c).Ĉiuj rezultoj montris, ke DARS-AS1 interrompis PACT kaj PKR-komunikadon.
Ko-lokigo de PACT kaj PKR en kontrolĉeloj aŭ ĉeloj troesprimantaj DARS-AS1 estis observita uzante konfokusan fluoreskecmikroskopion.La nukleoj estis makulitaj per DAPI.Statistikaj rezultoj estis akiritaj de 16 fotoj.b Co-immunoprecipitation (ko-IP) uzanta kontraŭ-PACT-antikorpon en ĉelaj lizatoj de kontrolo SW620-ĉeloj aŭ ĉeloj troesprimante DARS-AS1.c Labeled PACT, purigita PKR kaj transskribita en vitro kun DARS-AS1 aŭ imita RNA estis kovataj por in vitro-proteina ligado-analizo.Kontraŭ-flagaj antikorpoj estis uzitaj por imunoprecipitado.d Immunoblots kun la indikitaj antikorpoj estis faritaj en SW620 kaj HCT116-ĉeloj transfektitaj kun kontrolo shRNA aŭ DARS-AS1-shRNA sekvita de serummalsato.e DARS-AS1-esprimniveloj ŝanĝis ĉelan sentemon al thapsigargin.SW620-ĉeloj estis transfektitaj kun DARS-AS1-shRNA, DARS-AS1-troesprimo-plasmido aŭ kontrolplasmido.Ĉeloj estis traktitaj kun thapsigargin dum 48 horoj kaj ĉela daŭrigebleco estis determinita uzante la MTS-reakciilon.f In vitro transskribita DARS-AS1 aŭ dummy RNA kaj purigita PACT estis uzataj por envitra aktiviga analizo kaj detekto de imunblot.g Immunoblots uzantaj ĉi tiujn antikorpojn estis faritaj sur SW620-ctrl-ĉeloj (maldekstre) aŭ ĉeloj troesprimantaj PKR-mutantojn (dekstre).Tiuj ĉeloj tiam estis transfektitaj kun kontrolo shRNA aŭ DARS-AS1-shRNA sekvita per serummalsato.h Fluocitometrio montris ke malaktivigo de la mutaciulo PKR kompensis por DARS-AS1-induktita apoptozo en SW620-ĉeloj.i Immunoblots kun la indikitaj antikorpoj estis faritaj en SW620 (maldekstre) aŭ HCT116 (dekstre) ĉeloj.Ĉeloj transfektitaj kun kontrolo-shRNA aŭ DARS-AS1-shRNA estas serum-senhavigitaj kaj kompletigitaj kun 100 nM PKR C16-inhibitoro aŭ DMSO.Skalstango = 5 µm.Datenoj montritaj estas la meznombro ± norma devio de tri eksperimentoj.* p ≤ 0,05 Duvosta Studenta t-testo.
Estas ĝenerale kredite ke post kiam PACT interagas kun PKR17, PKR-fosforiligo ĉe Thr451 povas esti induktita.Niaj rezultoj indikis, ke la nivelo de PKR-fosforiligo estis signife levita en DARS-AS1-knockdown-ĉeloj post seruma malsato (Fig. 4d kaj Suplementa Fig. 4a).Sekve, ni trovis, ke fosforiligo de eIF2α, la ĉefa PKR-substrato, ankaŭ estis signife pliigita de DARS-AS1-shRNA (Fig. 4d kaj Suplementa Fig. 4a).Thapsigargin estas ER-stresor kiu igas la ER liberigi Ca2+.Traktado kun thapsigargin estis raportita stimuli la esprimon kaj aktivigon de PACT, kiu plue interagas kun kaj aktivigas PKR, kondukante al apoptozo pliigante eIF2α-fosforilado 18,61.Ĉi tie, ni uzis thapsigargin kiel stimulilon de la PACT/PKR-vojo por esplori ĉu DARS-AS1 povas helpi ĉelojn venki streson malhelpante la PACT/PKR-vojon.Ni observis, ke la nivelo de DARS-AS1-esprimo pozitive korelaciis kun ĉela rezisto al thapsigargin.SW620-ĉeloj superesprimantaj DARS-AS1 pluvivis pli bone kiam traktitaj kun thapsigargin, dum ĉeloj kun DARS-AS1-knockdown iĝis pli sentemaj (Fig. 4e).Konsekvence kun ĉi tiuj rezultoj, DARS-AS1-troesprimo reduktis thapsigargin-induktitan PKR-fosforiladon (Suplementa Fig. 4b).Kontraste, post thapsigargin-traktado, PKR kaj eIF2α estis fosforilitaj en pli alta mezuro en DARS-AS1-knockdown-ĉeloj kompare kun kontrolĉeloj (Suplementa Fig. 4b).Kurioze, thapsigargin induktis DARS-AS1-esprimon laŭ dozo-dependa maniero, kio povas indiki kontraŭ-stresan funkcion de DARS-AS1 (Suplementa Fig. 4c).Krome, ni faris in vitro-aktivigajn provojn por konfirmi ĉi tiujn observojn.Mallonge, PKR estis purigita de ĉelaj lisatoj uzante kontraŭ-PKR-antikorpon, tiam kovita kun rekombina PACT kaj DARS-AS1 transskribita en vitro.Post la enzimeca reago, fosfo-PKR estis detektita uzante WB.Niaj rezultoj indikis, ke PKR-fosforiligo estis signife malhelpita de DARS-AS1, sed ne de kontrola RNA (Figuro 4f).Tiuj en vitro kaj en vivo rezultoj indikas ke DARS-AS1 malhelpas PACT-mediaciitan PKR-aktivigon.Samtempe, ni ankaŭ observis malpliiĝon de PACT-reakiro en la ĉeesto de DARS-AS1 (Figuro 4f).Ĉi tiu rezulto kongruas kun la rezultoj de la in vitro-proteina ligado (Figuro 4c) kaj denove ilustras la blokan funkcion de DARS-AS1 por PACT-PKR-asocio.
Ser246 kaj Ser287 en la D3-domajno de PACT estas postulataj por PKR-aktivigo sub ĉela streso.Anstataŭigo de du serinrestaĵoj por alanino donis mutaciulon PACT (mutD), kiu aktivigis PKR en la foresto de streso, kaj anstataŭigo por alanino (mutA) inversigis la protokolon.Ĉar ni pruvis la gravecon de ĉi tiu domajno en rekta asocio kun DARS-AS1, ni generis ĉi tiujn du PACT-mutaciulojn por testi ĉu ĉi tiuj restaĵoj ankaŭ povus esti implikitaj en interagado kun DARS-AS1.Kurioze, ambaŭ mutaciuloj perdis la kapablon ligi al DARS-AS1 (Suplementa Fig. 4d), sugestante, ke la kompleta strukturo de la PACT-proteino povas esti postulata por efika interago kun DARS-AS1.
Krome, niaj rezultoj ankaŭ sugestas, ke DARS-AS1-shRNA-induktita inhibicio de ĉela proliferado povas esti parte restaŭrita per superesprimado de dominanta negativa PACT-mutaciulo (PACTmutA) aŭ domina negativa PKR-mutaciulo (PKRmut) (Suplementa Fig. 4e. e).Troesprimo de domina-negativaj PKR-mutaciuloj reduktis PKR-fosforiligon induktitan per DARS-AS1-knockdown same kiel eIF2α-fosforilado en serum-privitaj ĉeloj (Fig. 4g).Pli grave, la proporcio de apoptotaj ĉeloj induktitaj de DARS-AS1-knockdown ankaŭ estis reduktita en ĉeloj superesprimantaj PKRmut (Fig. 4h kaj Suplementa Fig. 4g).Inhibicio de PKR-kinaza agado ankaŭ difektas DARS-AS1-funkcion, ĉar rezultoj montris, ke DARS-AS1-knockdown malofte ekigis PKR kaj eIF2α fosforiligon kiam ĉeloj estis traktitaj per PKR-specifa C16-inhibitoro (Fig. 4i kaj Suplementa Fig. 4h).).Kunigitaj, niaj rezultoj sugestas, ke DARS-AS1 antaŭenigas ĉelan proliferadon, almenaŭ parte, malhelpante PACT-mediaciitan PKR-aktivigon.
Por plu esplori la rolon de DARS-AS1 en tumorogenezo, ni faris en vivo-eksperimentojn uzante musan ksenograft-modelon. Rezultoj montras, ke knockdown de DARS-AS1 draste malpliigis tumoran kreskon en musoj (p-valoro <0.0001) (Fig. 5a). Rezultoj montras, ke knockdown de DARS-AS1 draste malpliigis tumoran kreskon en musoj (p-valoro <0.0001) (Fig. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (знашей (значе 0.01)5 (значе 0.015). La rezultoj montras, ke DARS-AS1-knockdown draste reduktas tumoran kreskon en musoj (p-valoro <0.0001) (Figuro 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей у мышей (значительно снижает рост опухоли у мышей 01 (значительно)). La rezultoj montris, ke DARS-AS1-knockdown signife reduktis tumoran kreskon en musoj (p-valoro <0.0001) (Figuro 5a).Tiel, en la knokaŭta grupo DARS-AS1, estis signifa malkresko de averaĝa tumorvolumo je ĉirkaŭ 72.9% kaj meza tumora maso je ĉirkaŭ 87.8% (Figuro 5b-d).Tiuj rezultoj forte indikas ke DARS-AS1 povas signife antaŭenigi tumorkreskon en vivo.
Efikoj de anonca DARS-AS1-frapo sur kolorekta onkogenezo en nudaj musoj.Kreskaj kurboj (a), tumorgrandeco (b), pezo (c), kaj tumorbildoj (d) estas montritaj.Eraraj stangoj reprezentas ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, per duvosta Studenta t-testo. n = 10. ****p < 0,0001, per duvosta Studenta t-testo. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 Duvosta Studenta t-testo.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 Duvosta Studenta t-testo.Kaplan-Meier analizis la korelacion inter DARS-AS1-esprimniveloj kaj ĝenerala supervivo en pacientoj kun UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM kaj LGG.Altaj niveloj de DARS-AS1-esprimo en pacientoj estis en la supraj 50%;la malalta nivelo de DARS-AS1-esprimo en pacientoj estis en la malsupraj 50%.p-valoroj estis determinitaj per la registro-ranga testo.f Proponita modelo en kiu DARS-AS1 reguligas la PACT-PKR-padon kaj tumorkreskon.
Por pli bone kompreni la klinikan efikon de DARS-AS1, ni ekzamenis la korelacion inter ĝia esprimo kaj pacienca postvivado.Analizante la TCGA-datumaron, ni trovis, ke pli alta DARS-AS1-esprimo estis asociita kun uvea melanomo (UVM), rena kromofobio (KICH), rena papilara ĉelkarcinomo (KIRP), mezoteliomo (MESO), multiplekso.Pli malalta supervivo estis signife asociita kun glioblastoma morfozo (GBM) kaj pacientoj kun malalt-grada cerba gliomo (LGG) (Figuro 5e).Tiuj rezultoj indikas ke DARS-AS1 povas ludi gravan rolon en klinika tumorprogresado kaj povas esti ebla prognoza biosigno en multoblaj kanceroj.
En ĉi tiu studo, uzante grandskalan CRISPRi-funkcian kribradon, ni determinis, ke DARS-AS1-lncRNA venkas kancerĉelan streson per reguligo de du ŝlosilaj stresrespondantoj, PACT kaj PKR.Interagante rekte kun PACT, DARS-AS1 malhelpis PACT-mediaciitan PKR-aktivigon, tiel malhelpante apoptotan ĉelan morton kaj antaŭenigante ĉelan proliferadon (Fig. 5f).Supreguligo de DARS-AS1 estis observita en multoblaj specoj de kancero, sugestante ke ĝia funkcio de antaŭenigado de kancerĉelsupervivo sub streĉaj kondiĉoj povas esti larĝe uzebla al multoblaj specoj de kancero.
PACT estis identigita kiel PKR-aktivigproteino, kaj PACT-mediaciita PKR-aktivigo ludas gravan rolon en stresrespondoj per reguligado de transskribo, traduko, apoptozo kaj aliaj gravaj ĉelaj procezoj62.Dum jardekoj, provoj estis faritaj por kompreni la kancer-specifan reguligon de la PACT-PKR-kaskado.Ĉi tie, nia studo rivelis malsaman mekanismon de reguligo de PACT-PKR en kanceraj ĉeloj per ĉela lncRNA DARS-AS1, kiu rekte ligas al PACT, blokas PACT-PKR-interagadon, malhelpas PKR-aktivigon kaj eIF2α-fosforiligon, tiel malhelpante stres-induktitan apoptozon kaj stimulante eventualan kancero-multiĝon.ĉeloj.Ĉi tiu malkovro lumigas eblajn lncRNA-celojn por kancerprognozo kaj terapio.
Niaj datumoj montris, ke DARS-AS1-frapo sentigas ĉelojn al serummalsato kun signifa pliiĝo en fosforilata PKR kaj eIF2α.Tiuj rezultoj indikas ke DARS-AS1 antaŭenigas kancerĉelsupervivon sub severaj kondiĉoj malhelpante PACT/PKR-agadon.Pluraj aliaj ne-kodaj RNAoj, kiel ekzemple ASPACT kaj nc886, ankaŭ estas engaĝitaj en la PACT/PKR-akso subreguigante PACT48-mRNA aŭ reguligante aŭtofosforiligo per ligado al PKR49,50,64.Inter ili, DARS-AS1 funkcias kiel interrompanto de la asocio PACT-PKR.Ĉi tiu studo riĉigas nian komprenon pri PACT/PKR-aksa reguligo kaj la rolo de lncRNA-oj en streĉaj respondoj.
PACT enhavas tri apartajn domajnojn.Ĉiu el la unuaj du dsRBDs sufiĉas por atingi altan afinecligadon de PACT al PKR, dum la tria domajno (D3) estas postulata por PKR-aktivigo en vitro kaj en vivo.Nia studo montris, ke DARS-AS1 prefere interagas kun la domajno D3 (Fig. 3h).Surbaze de la granda grandeco de la lncRNA (768 nukleotidoj), DARS-AS1 liganta al D3 povas fizike malhelpi la interagadon inter la PACT-domajno de dsRBD kaj PKR, tiel blokante la asocion de PACT kaj PKR.PACT-punktaj mutacioj kiuj anstataŭigis Ser246 kaj Ser287 en D3 kun alanino aŭ aspartato interrompis ĝian devigan afinecon por DARS-AS1, montrante al la graveco de la totalaj strukturaj kaj elektraj trajtoj de D3 en sia asocio.Pliaj detaloj de ĉi tiu mekanismo estos postulataj estonte, uzante pli precizan biokemian analizon kaj alt-rezolucian PACT-strukturan analizon.
Antaŭaj studoj raportis, ke DARS-AS1 antaŭenigas ĉelan proliferadon per pluraj mekanismoj51,52,53.En unu ekzemplo, enketistoj observis ke DARS-AS1 plialtigis ĝian kontraŭsensan protein-ĉifradan DARS-genon celante miP-194-5p en renaj kanceraj ĉeloj.Tamen, en la nuna studo, la frapo de DARS-AS1 havis malmulte da efiko al DARS-transskribo en multoblaj specoj de kancero, inkluzive de almenaŭ kolorekta, mamo kaj hepataj kanceroj.Ĉar lncRNA-oj elmontras ĉel- kaj histo-specifajn esprimpadronojn, funkciaj mekanismoj eble ne estas konservitaj trans kancerspecoj, kiuj povas kontribui al ĉi tiu diferenco inter niaj observaĵoj kaj antaŭaj taksoj de malsamaj kanceroj.Specialaj studoj estas necesaj por klarigi la specifajn mekanismojn de diversaj fiziologiaj kaj patologiaj procezoj.
Analizo de klinikaj datumoj montris, ke DARS-AS1-esprimo en tumoroj estas inverse korelaciita kun la supervivo de kanceruloj, kio substrekas la gravecon de la DARS-AS1/PACT/PKR-akso en kancero-prognozo.Konklude, nia studo montras, ke DARS-AS1 estas reguliganto de la signala akso PACT/PKR, antaŭenigas kancerĉelan proliferadon kaj malhelpas apoptozon dum la streĉa respondo, kiu provizas alian esplorlinion kaj interesas estontajn esplorojn pri eblaj traktadoj. .
Homaj ĉellinioj SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 kaj HEK293T estis akiritaj de la Nacia Ĉellinia Rimeda Infrastrukturo en Ĉinio.Ĉiuj ĉeloj estis konservitaj en DMEM-medio (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) kompletigita kun 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) kaj 1% penicilino-streptomicino (Thermo Fisher Scientific) je 37 °C, 5% CO2.inkubatoro.
Kontraŭ-PACT, Abcam (ab31967);Kontraŭ-PKR, Abcam (ab184257);Kontraŭ-PKR (fosfo-T451), Abcam (ab81303);Kontraŭ-Flago, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));kontraŭ-eIF2α (fosforo S51), Abcam (ab32157);kontraŭ-PACT (fosforo S246), Abgent (AP7744b);kontraŭ-β-tubulin, CST (2128);normala muso IgG, CST (5415S);normala kuniklo IgG, CST (2729S).Antikorpoj estis diluitaj 1:1000 en PBST por okcidenta makulado kaj 1:100 por IP.
sgRNAoj estis evoluigitaj uzante publike haveblan ilon nomitan CRISPR-ERA66.Ni uzis la defaŭltajn ilajn parametrojn por sgRNA-disvolviĝo kaj la algoritmo komputis sgRNA-ligejojn en la 3 kb-regiono.centrita ĉe TSS.Pools de sgRNA-oligonukleotidoj estis sintezitaj ĉe CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) kaj klonitaj en humanigitajn pgRNA-plasmidojn (Addgene #44248).Totalo de 12 µg de kunigita humanigita pgRNA-plasmido, 7.2 µg de psPAX2 (Addgene numero 12260), kaj 4.8 µg de pMD2.G (Addgene numero 12259) estis ko-transfektitaj en 5 x 106 HEK293T en 10 cm transfektaj reakciiloj de DNA. ĉeloj (CWBIO, Pekino, Ĉinio) sekvante la instrukciojn de la fabrikanto.Virus-enhavantaj supernatantes estis kolektitaj 48 kaj 72 horojn post transfekto kaj filtritaj tra 0.45 µm filtrilo.Por ekzamenado, SW620-ĉeloj esprimantaj la dCas9/KRAB-fuzioproteinon estis akiritaj per virustransdukto.Modifitaj SW620-ĉeloj estis infektitaj kun la virusbiblioteko en kvar sendependaj infektaj eksperimentoj ĉe MOI de 0.1-0.3 kaj estis provitaj kun 2 μg/ml puromicin (Sigma, St. Louis, MO) dum 2 tagoj.Poste, ĉeloj estis kultivitaj dum 18 tagoj en vitro kun minimuma bibliotekpriraportado de 500 ĉeloj/sgRNA por ekzamenado.
Genomic DNA estis ĉerpita laŭ la instrukcioj de la QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Duseldorfo, Germanio; 51183).Entute, 100 μg da genoma DNA per biologia ripeto estis uzataj por konstrui la bibliotekon.La sgRNA-regiono estis plifortigita per du preterpasas de PCR kaj ligita al strekkodo.
PCR-produktoj estis purigitaj per NucleoSpin®-ĝelo kaj PCR-puriga ilaro (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germanio; 740609.250) kaj kvantigitaj per Qubit™ HS-du-fadena DNA-detekta ilaro (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
La MTS-analizo estis uzita por mezuri ĉelmultobliĝon.Ĉeloj estis semitaj en 96-putaj platoj ĉe komenca denseco de 2000 ĉeloj/puto.La relativa nombro da ĉeloj estis mezurita ĉiutage je la indikita tempo dum totalo de 4-6 tagoj.Por ĉiu puto, 20 μl da MTS-reakciilo (Promega) estis diluitaj per 100 μl da DMEM, kovataj kun ĉeloj dum 4 horoj je 37 °C, kaj tiam OD490 estis mezurita.
La kapacito por neankrita kresko estis malkovrita analizante la formadon de sferoj.Mallonge, 2000 ĉeloj transfektitaj kun shRNA DARS-AS1 aŭ kontrolo shRNA estis kultivitaj en ultra malaltaj alligaj mikroplatoj (Corning) kun meza ŝanĝo ĉiujn 4 tagojn.La sferoidoj estis nombritaj post 14 tagoj.500 ĉeloj transfektitaj kun la DARS-AS1 troesprimo-plasmido aŭ kontrolplasmido estis uzitaj por la pliboniga analizo, alie la metodo estis senŝanĝa.
RNA estis transskribita per T7 RNA polimerazo kaj biotin-16-UTP (Roche 1138908910) laŭ la instrukcioj de Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).La enkondukoj uzataj ĉi tie estas listigitaj en Suplementa Tabelo 4.
Protein-kodaj PACT aŭ PKR-regionoj estis klonitaj en pET15b (Addgene numero 73619) kaj transformitaj en BL21 (DE3).La bakterioj estis kovataj dum la nokto en LB provizita per ampicilino kaj poste diluitaj 100-oble per freŝa LB.Kiam la OD600 de la medio atingis 0.8, 1 mM IPTG estis aldonita por stimuli proteinan esprimon.Post kovado dum la nokto kun milda skuado (250 rpm je 20 °C), la ĉela buleto estis kolektita per centrifugado (4000 rpm, 10 min, 4 °C).Resuspendu la ĉelan buleton en liza bufro (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) kaj kovu sur glacio dum 30 min, poste soniku (15 min, 5 s on/off, sur glacio) kaj centrifugu (13,000). rpm)., 30 min, 4°С).La supernatanto estis tiam ŝarĝita sur Ni-NTA-rezino (QIAGEN) 3 fojojn je 4 °C, lavita 4 fojojn kun lavbufro (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazolo, 250 mM NaCl) kaj eluita 3 fojojn, kun totalo. de 10 ml eluvbufro (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Purigita proteino estis determinita uzante WB kaj la koncentriĝo estis determinita per la Qubit ™ proteina analizo ilaro (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-analizoj estis faritaj kiel antaŭe priskribite, kun modifoj.Mallonge, 1x RIP-bufro (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin-ribonukleazo-inhibitoro (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteazo) lizas citostatikan koktelon 1 x 107. (Roche, 1 mM DTT) kaj centrifugu je 13,000 rpm dum 15 min je 4 °C.La supernatant estis tiam kovita kun proteino A+G magnetaj bidoj (Millipore) konjugaciita kun 5 μg da kontraŭ-PACT-antikorpo (Abeam) aŭ IgG (CST).La bidoj estis lavitaj 5 fojojn per 5x RIP-bufro, tiam digestitaj per proteinazo K (NEB).RNA estis ĉerpita kun Trizol kaj determinita per RT-qPCR.Enkondukoj estas prezentitaj en Suplementa Tabelo 5.
La en vitro RIP-analizo estis farita laŭ modifita norma RIP-analizo-protokolo.Entute 5 pmol da in vitro transskribita RNA estis diluita 1x kun RIP-bufro kaj kalzita per kovado je 65 °C dum 5 minutoj sekvitaj de malrapida malvarmigo al ĉambra temperaturo.Totalo de 5 pmol da sendifektaj aŭ mutaciitaj flag-etikeditaj PACT-proteinoj estis purigitaj de E. coli.Kovu kun renatura RNA dum 2 horoj je 4 °C kaj sekvu la ĉi-supran proceduron por RIP-analizo por kontraŭ-flaga IP.
Por analizo de etendaĵo de RNA, 1×107 ĉeloj estis lizitaj kun 1xRIP-bufro.Post centrifugado je 13,000 rpm dum 15 minutoj je 4 °C, la supernatante estis antaŭtraktita per 30 μl da streptavidinaj magnetaj bidoj (Beckman) dum 2 h je 4 °C.La purigita lisato estis tiam provizita per gista tRNA kaj kovita kun 40 pmol da renatura RNA dum la nokto je 4 °C, tiam dum pliaj 2 horoj kaj 20 μl da novaj streptavidinaj magnetaj bidoj blokitaj per BSA estis aldonitaj.La lava paŝo konsistis el 4 fojojn per 5x RIP-bufro kaj 4-foje per 1x RIP-bufro.La respondaj proteinoj estis eluitaj kun biotina elucia bufro (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotino, PMSF) kaj apartigitaj sur NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Post arĝenta makulo (Beyotime Biotechnology), certaj grupoj estis eltranĉitaj kaj analizitaj fare de MS.
Ko-IP-analizo estis farita por testi la interagadon inter PACT kaj PKR.Mallonge, supernataj lisaĵoj estis preparitaj per kovado de 1 x 107 lizitaj ĉeloj en 1 x RIP-bufro sekvita de centrifugado je 13,000 rpm dum 15 minutoj je 4 °C.Lisatoj estis ŝarĝitaj kun proteino A + G magnetaj bidoj, konjugitaj kun 5 µg da kontraŭ-PACT-antikorpo, kaj milde turnitaj dum la nokto je 4 °C.La bidoj estis lavitaj 3 fojojn per 5×RIP-bufro, dufoje per 1×RIP-bufro kaj eluitaj per 1×SDS-bufro.La reakirita proteino estis analizita per SDS-PAGE-ĝelo kaj detektita de WB.
Du pmol de markita PACT kaj 1 pmol de PKR estis purigitaj de E. coli.Diluu en 1× RIP-bufron kaj kovu kun 10 pmol de renatura RNA dum 2 horoj je 4 °C.Post tio, ili estis kovataj kun proteino A+G magnetperlokonjugaciita kontraŭ-etikedita antikorpo dum pliaj du horoj.La bidoj tiam estis lavitaj kvar fojojn per 1x RIP-bufro kaj eluitaj per 1x SDS-bufro.La rezulta PACT kaj PKR estis detektitaj fare de WB.